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高温水解复杂混合物中的含半乳糖的低聚糖的方法
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发布时间：2021-03-25
专利名称:高温水解复杂混合物中的含半乳糖的低聚糖的方法
本发明涉及利用嗜高温酶水解低聚糖来加工动物饲料和其它复杂底物的方法。
α-半乳糖苷酶(本文中也被称作α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC3.2.1.22，α-gal或Gal36)是一种外切作用糖苷酶，该酶催化从含单纯半乳糖的低聚糖的非还原末端水解α-1→6连接的α-D-半乳糖残基。这些低聚糖的实例包括棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖和蜜二糖，以及更复杂的多糖。
胞内和胞外的α-gal广泛分布于微生物、植物和动物体内。编码α-gal的基因已被从包括人、植物、酵母、丝状真菌和细菌在内的多种来源中克隆出来。基于一级结构的相似性和疏水簇分析，按照糖基水解酶的常规分类方法已经将α-gal分为三个高度保守的家族。来源于细菌的α-gal被分为家族4和36，来源于真核生物的α-gal被分为家族27。
Huber等，微生物学文献(Arch.Microbiol).144，324-333(1986)中记载了细菌海栖热袍菌的分离。海栖热袍菌是一种严格厌氧的、棒状的、发酵型、嗜高温的、和在55℃至90℃范围内生长的，最适生长温度约为80℃的真细菌。该真细菌是从意大利和亚速尔群岛的被地温加热的海底分离出来的。那不勒斯栖热袍菌是另一种与海栖热袍菌相关的嗜高温真细菌。从海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌中分离的酶包括β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和半纤维素酶。在已知的α-gal中，只有嗜高温细菌海栖热袍菌的α-gal(TmGalA)和那不勒斯栖热袍菌的α-gal(TnGalA)表现出活性以及在75℃以上持久的稳定性。
动物饲料制剂通常配制成具有平衡的碳水化合物和蛋白质含量，并且被调节成适合于特定动物的生活周期的不同阶段。在许多动物饲料中，含有大量的大豆饼粉。例如，小鸡食物中的大豆饼粉约占蛋白含量的20至30％。
大豆富含蛋白，尤其是富含氨基酸赖氨酸和苏氨酸，但是蛋氨酸的含量很低。蛋白含量高是在动物饲料和人类食品(即，婴儿配方)中广泛使用大豆的原因。据估计，美国大豆饼粉的工业产量是六十亿美元，美国每年大豆饼粉产量的约80％被用于动物饲料中。
大约15％的大豆饼粉不能被单胃动物消化。该15％构成了家禽食物中的食物纤维(为不溶性纤维)。通常，约百分之三至五的该不溶性部分是棉子糖-低聚糖。在其它食物中，如基于豆类或小麦的食物中，棉子糖-低聚糖含量更高，接近35％，并且构成了那些特定类型饲料中的抗营养碳水化合物的大部分。
未被消化的低聚糖的存在可能会对动物饲料能量的最佳利用产生不良的后果。对动物饲料进行酶促处理能够提高可消化和可溶解碳水化合物的可利用性。饲料的表观代谢能(AME)的少量增加能够使成本显著降低。通过去除抗营养因子(即不可消化的低聚糖)、提高可利用碳水化合物组分的消化率以及提高不溶性部分的水溶性可以获得AME的增加，从而使饲料的消耗量减至最小。
典型的大豆饼粉加工顺序的总体方案在动物饲料加工中一般有典型性。在动物饲料的加工过程中，尤其是在含大豆饼粉的动物饲料的加工过程中，利用沸己烷对饲料进行处理以便除去大豆物质(即，大豆片)中的油。然后从油中将所述己烷蒸馏出来并加以回收。己烷处理后，用蒸汽将所述饲料处理一至两分钟以便使蛋白变性以及破坏蛋白酶抑制剂。热处理主要是为了使粉料中的蛋白酶抑制剂变性。这尤其适用于大豆，因为大豆中含有大量的蛋白酶和蛋白酶抑制剂。在该步骤中，含水量被提高到约20％，该步骤在动物饲料加工的全过程中一般是含水量最高的步骤。残余的脲酶活性通常被用作确定蛋白变性程度的量度标准。蒸汽处理后，将所述饲料送到一个脱溶剂器/蒸缸中。在这里，饲料被加热或“蒸煮”从而驱赶掉残余的己烷并使含水量降低到约14％。在该步骤中蛋白进一步发生了变性。蒸缸操作完成后，所述饲料在约180°F(82℃)的温度下(例如，通过挤压)被制成颗粒状物。所述制粒或挤压过程通常持续大约几十秒钟。冷却后，可以使含水量再降低2％至约12％的总含水量。
用于酶促处理动物饲料的该技术通常利用嗜中温来源的酶来制造消化率以及营养价值得到提高的动物饲料。由于所述酶的热稳定性较低以及饲料加工过程中涉及到的高温，这些酶通常必须被用于制粒后的饲料配制的最终加工步骤中。所述的制粒物理加工通常包括加热饲料和通过压模挤压饲料。所述高温对于驱赶掉过量水分和将饲料‘熔解’成颗粒是必需的，否则过量的水分会阻碍结粒。大多数制粒设备能够加工大约1000kg/小时的饲料。
随着颗粒从制粒机中落下并被空气冷却，将酶加到新形成的颗粒中。通常将所述酶溶液从喷嘴垂直喷在落下的饲料颗粒上。以这种方式将酶涂在颗粒上是一种无效的方法，因为(1)酶喷涂率受到所述酶溶液中的含水量的限制(如果所述颗粒被喷得太湿则发生崩解，并且颗粒中含水量高则在贮存过程中促进霉菌和真菌的生长)，和(2)由于这种限制以及颗粒形成得太快，饲料颗粒经常不能被酶完全地包裹起来。当采用这种技术时，估计实际上大约只有五分之一的颗粒被酶包裹起来。
另外，嗜中温酶在动物体内(即，消化后)指标订为活性。由于动物消化道内的pH和蛋白酶的存在，使外源性施加的酶的有效性变得非常低。
因此，需要向动物饲料中施加酶，使得不可消化的低聚糖在被动物摄食之前被分解成单体，并且所述酶在饲料加工采用的高温下具有稳定性。
除了降低人和动物食物中的表观代谢能(AME)外，人和动物食物中的不可消化的低聚糖的存在也是不利的，因为低聚糖的存在会引起胃肠病痛(例如，肠胃气胀和其它胃肠症状)。某些引起肠胃气胀的食物包括豆类(例如，花生、菜豆)、一些十字花科的植物(例如，卷心菜、抱子甘蓝)和某些水果(例如，葡萄干、香蕉、杏)。上述食物引起肠胃气胀的主要原因是机体不能消化这些食物中所含的某些碳水化合物(即，棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖)。由于哺乳动物不具备消化这些碳水化合物的能力，从而使得腐败细菌在大肠中通过发酵来分解这些碳水化合物。结果形成过量的直肠气体，主要是二氧化碳、甲烷和氢气。由于人和其它单胃哺乳动物的消化系统不产生α-半乳糖苷酶或者产生量微乎其微，所以人和其它单胃哺乳动物很难消化这三种低聚糖来释放D-半乳糖。
已知体外利用α-半乳糖苷酶能够使得上述的低聚糖可消化。美国专利US3,966,555；4,241,185；和4,431,737分别公开了通过培养多种微生物来生产和/或稳定α-半乳糖苷酶的方法并且提示了α-D-半乳糖苷酶可被体外用于食品加工和/或通过添加到食品中维持长达12小时。在R.Cruz，等，食品科学杂志(Journal of Food Science)46，1196-1200(1981)中记载了通过添加α-半乳糖苷酶体外水解α-D-半乳糖苷连接的糖。
授予Rohde等的美国专利US5,436,003记载了一种利用含有β-呋喃果糖苷酶、纤维素酶和半纤维素酶的组合物减轻胃肠病痛的方法。以BEANO商标由AkPharma进行销售的液体产品已被描述为一种能够减少或消除肠内气体的酶或食品添加剂，所述肠内气体是当食用了食物如菜豆、花椰菜、糠和其它作为低脂肪、高纤维健康食物的蔬菜和谷物时产生的。BEANO产品含有得自黑曲霉的α-半乳糖苷酶。
不幸的是，存在着某些与已知的利用α-半乳糖苷酶对食物进行体外加工有关的问题，所述加工是为了水解α-D-半乳糖苷连接的糖从而减轻哺乳动物摄取这些糖后出现的症状。通常，所述酶被施加到已被制好的(即煮熟的)食物中。利用酶促方法对完整的(即，未被浸软的或未被咀嚼的)菜豆或其它蔬菜和水果进行处理的效率低且成本高。由于这些食物的坚硬特性，酶只能与底物的外部接触，所以使得酶促反应的效率低、酶活性不可能始终如一和完全有效。最后，利用α-半乳糖苷酶的本方法通常包括在食用食物之前直接使用酶；因而，酶主要在食用后以及消化过程中发挥作用。由于嗜中温α-半乳糖苷酶在高温下的热不稳定性，所以目前使用的产品不能在制作(即，蒸煮、加热)食物之前施用到食物中。所希望的是能够利用一种高温下稳定的α-半乳糖苷酶在以下方面为食品的消费者提供更多的灵活性(1)含不合乎需要的低聚糖的食物的制作和(2)在消化前水解不需要的低聚糖的能力。
本发明人已经发现某些嗜高温酶具有作为改善动物饲料和人类食品品质的加工添加剂的用途。
本发明利用了嗜高温来源的α-半乳糖苷酶，例如来源于海栖热袍菌DSM3109的α-半乳糖苷酶通过水解存在于动物饲料中的含半乳糖的低聚糖而直接处理动物饲料。通过将嗜高温α-半乳糖苷酶制剂直接添加到包括含半乳糖的低聚糖的底物组合物(如含大豆饼粉的动物饲料)中来完成酶处理。本发明的一个优势在于能够在高温，即在通常与动物饲料配制或加工有关的工业加工过程中经常遇到的温度下使用所述酶。
而且，在这些较高的温度下，底物能够更加充分地接近酶，从而使得酶与底物能够完全接触。在酶活性必需的高温下，酶活性所需要的含水量条件被降低了。酶对底物的活性程度还可以通过调节混合物在高温下维持的时间来控制。
因此，本发明一方面涉及一种新的水解含半乳糖的低聚糖的方法，该方法通过使嗜高温α-半乳糖苷酶与一种包括含半乳糖的低聚糖的复杂底物(例如，动物饲料)进行接触，然后加热所述混合物来促进酶介导的水解。
另一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包括一种嗜高温α-半乳糖苷酶与含有含半乳糖的低聚糖的复杂底物(如大豆饼粉、大豆片或动物饲料)的混合物。
本发明的第三个方面涉及一种包括嗜高温来源的α-半乳糖苷酶的组合物，所述α-半乳糖苷酶可被用作一种食品添加剂来减轻人和动物的胃肠病痛。
本发明的第四个方面涉及一种包括嗜高温来源的α-半乳糖苷酶的组合物，所述α-半乳糖苷酶可被用作，例如植物蛋白(即，大豆蛋白)分离过程中的，一种加工添加剂。这种添加剂可用于促进从蛋白产品中去除低聚糖和半乳糖单体，从而预防或减轻人和动物的胃肠病痛。
由于本发明酶的热稳定性高，以及酶在高温下仍具有活性，所以本发明允许在给动物喂食之前，在高温饲料加工过程中对动物饲料进行酶促改性处理。由含水量增高引起的贮存问题由于制粒后酶的施用不再是必需的而得到缓解或解决。由于对较小颗粒(即，与成品颗粒产品相比)进行处理时传质阻力降低，因而实现了酶促效率的提高。最后，含半乳糖的低聚糖的水解使得所述饲料的营养值得到提高(即，被动物可利用的食物能量更加有效)。
因此本发明提供了一种水解存在于底物中的含半乳糖的低聚糖的方法，包括使所述底物与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，并且将底物加热到嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，在该温度下保持一段足以水解所述低聚糖的时间。在一优选的实施方案中，所述低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。在另一个优选的实施方案中，所述底物是动物饲料、大豆饼粉或人类食品。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM3109。在另一个优选的实施方案中，所述低聚糖被水解成半乳糖单体。在另一个优选的实施方案中，所述方法在70％或25％的含水量条件下进行。在另一个优选的实施方案中，所述加热在80℃、85℃、90℃或100℃下进行。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。在另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了一种制备含有被水解的含半乳糖低聚糖的动物饲料组合物的方法，包括在动物饲料的加工过程中使所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，其中在所述动物饲料加工过程中的加热步骤之前使嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组分接触足够长的一段时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解含半乳糖的低聚糖。在一优选的实施方案中，所述含半乳糖的低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。在另一个优选的实施方案中，所述动物饲料包括大豆饼粉、大豆片或是鸡饲料。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM 3109。在另一个优选的实施方案中，所述低聚糖被水解成半乳糖单体。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶与动物饲料组合物的组分是在70％、25％或45％的含水量条件下进行接触的。在另一个优选的实施方案中，所述加热是在80℃、85℃、90℃或100℃下进行的。在另一个优选的实施方案中，所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶是在动物饲料加工过程中的最后制粒步骤之前进行接触的。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。优选地，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ IDNO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
在另一个优选的实施方案中，当所述嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组合物的组分进行接触的时候，所述嗜高温α-半乳糖苷酶是液体溶液的形式，干燥的形式、部分纯化或基本纯化的形式。
本发明进一步提供了一种由上述任意一种方法生产的动物饲料。
本发明进一步提供了一种用于减轻哺乳动物胃肠病痛的并且含有嗜高温α-半乳糖苷酶的食品添加剂。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM3109。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。优选地，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ IDNO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了
一种预防哺乳动物胃肠病痛的方法，其中所述胃肠病痛由含有至少一种选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的低聚糖的食物所引起，所述方法包括使所述食物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；然后将所述食物加热足够长的时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解所述的低聚糖。
本发明进一步提供了一种用于在可食用大豆蛋白的加工制作过程中去除含半乳糖的低聚糖的加工添加剂，该加工添加剂含有嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了一种从被用来加工生产可食用大豆蛋白的大豆底物中去除含半乳糖的低聚糖的方法，包括(a)使所述大豆底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；(b)在一定温度下将所述大豆底物加热足够长的时间从而使所述含半乳糖的低聚糖发生水解；和(c)在最终萃取或分级分离可食用大豆蛋白之前从所述大豆底物中去除被分解的含半乳糖的低聚糖。在一个优选的实施方案中，所述加热在从大豆底物中去除油之前进行。在一个优选的实施方案中，所述加热在从大豆底物中去除油之后进行。在一个优选的实施方案中，所述大豆底物是大豆片。
本发明进一步提供了一种由上述任意一项方法生产的可食用的分离大豆蛋白。
本发明的上述以及其它方面通过以下的说明得到详细的解释。
序列表的简要描述SEQ ID NO1海栖热袍菌DSM 3109 galA或gal36基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO2由SEQ ID NO1编码的氨基酸序列。
所述核苷酸序列始于翻译起始密码子GTG。上游的核糖体结合位点序列被省略了。在如本文所述的对该基因进行克隆的过程中，翻译起始密码子GTG被改变为ATG从而有利于插入到紧接在所述核糖体结合位点后面的pET24d+中的唯一NcoI位点中。
附图的简要描述
图1是海栖热袍菌Gal A对PNP-半乳糖的活性随pH变化而发生变化的曲线图。使用了下列缓冲液pH范围2.5至3.5，50mM柠檬酸盐；pH范围4至6，50mM醋酸钠；pH范围6.5至8.50mM磷酸钠。
图2是海栖热袍菌Gal A对PNP-半乳糖的活性随温度变化而发生变化的曲线图。所有测定都是采用50mM醋酸钠缓冲液，0.1M NaCl和1mM PNP-半乳糖进行的。
下面将参照所述附图对本发明进行更加充分的描述，其中叙述了本发明的优选实施方案。然而，本发明可以通过不同的形式来体现而且不应被理解为局限于本文所述的实施方案。相反，提供这些实施方案只是为了充分完整地公开本发明，从而使得本技术领域：
的技术人员充分地理解本发明的范围。
本发明说明书中使用的术语只是为了描述特定的实施方案而不是为了限制本发明。
除非上下文中另有说明，本发明说明书以及所附的权利要求
书中所使用的单数形式的″a″，″an″和″the″同时也包含了复数形式。
除非另有定义，本文中使用的全部科学技术术语具有本发明所属技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献被全文引入作为参考。
除非另有说明，可以采用常规方法来制备本发明的克隆基因、表达盒、载体(例如，质粒)、蛋白质和蛋白质片段。这类技术对于本技术领域：
的技术人员是已知的(参见例如，Sambrook等编辑的《分子克隆实验指南》第二版(Molecular CloningA Laboratory ManualSecond Edition)(冷泉港，纽约1989)；F.M.Ausubel等编辑的《精编分子生物学》(Current Protocols In Molecular Biology)(格林出版联合公司(Green Publishing Associates，Inc)和John Wiley amp;Sons公司，纽约)。
本文中公开的氨基酸序列是按照从左至右，以氨基到羧基的方向进行排列的。所述氨基和羧基没有在序列中体现出来。本文中只以单链的形式从左至右以5’至3’的方向列出了核苷酸序列。核苷酸和氨基酸是按照IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的方式或者(针对氨基酸)按照37CFR§1.822和固定用法，用三字母密码来表示的。参见例如PatentIn用户手册，99-102(1990年11月)(美国专利商标局)。
A.定义本文中的“蛋白”或“酶”是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。所述蛋白可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的肽模拟结构所构成。
因此本文中使用的“氨基酸”或“肽残基”既表示天然存在的氨基酸又表示合成的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。如果使用了非天然存在的侧链，例如为了防止或阻止发生体内降解，可以使用非氨基酸取代基。还可插入化学保护基团或其它化学取代基。
本文使用的“氯基酸序列”是指一种寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。α-半乳糖苷酶片段优选地保留α-半乳糖苷酶的生物活性。其中“氨基酸序列”被本文用来表示天然存在的蛋白分子的氨基酸序列，氨基酸序列等术语，并不意味着将所述氨基酸序列限定在与所述蛋白分子相关的完整和天然氨基酸序列。
本文使用的“扩增”是指制备多拷贝的核酸序列，并且“扩增”通常是利用本技术领域：
熟知的聚合酶链反应(PCR)技术(Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler(1995)PCR引物，实验指南，冷泉港出版社，Plainview，纽约)来进行的。
本文中使用的术语“核酸衍生物”是指编码α-半乳糖苷酶或者与α-半乳糖苷酶或被编码的α-半乳糖苷酶互补的经过化学修饰的核酸。这种修饰包括，例如氢被烷基、酰基或氨基所取代。一种核酸衍生物编码一种保留了天然分子的生物学或免疫学功能的多肽。一种衍生多肽是一种经糖基化、聚乙二醇化或任何类似方法修饰的而仍保留了原生多肽的生物学或免疫学功能的多肽。
本文使用的术语“同源性”是指互补的程度。可能有部分同源或完全同源(即，相同性)。一种至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列采用功能性术语“基本上同源的”来表示。在低严格条件下可以利用一种杂交分析方法(DNA印迹或RNA印迹，溶液杂交等)检测对完全互补序列与靶序列进行杂交的抑制程度。一种基本同源的序列或杂交探针将竞争并抑制完全同源序列与靶序列在低严格条件下的结合。这并不是说低严格条件是那种允许非特异性结合发生的条件；低严格条件需要两种序列之间的相互结合属于特异性(即选择性)的相互作用。通过利用甚至不具有部分互补程度(例如，相同性低于大约30％)的第二种靶序列可以检测不存在非特异性结合。在不存在非特异性结合的情况下，所述探针不与第二种非互补的靶序列发生杂交。
本文中的“核酸”或“寡聚核苷酸”或字义上的等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。尽管在某些情况下，具有本技术领域：
已知的替代性骨架的核酸类似物(例如磷酰胺；硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；O-甲基氨基磷酸酯键，以及肽核酸骨架和键)也被包括在内，但是本发明的核苷酸通常含有磷酸二酯键。
本文中交替使用的“核酸序列”和“多核苷酸”指的是一种寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段，以及单链或双链的并且代表有义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA。
如本文中所使用的术语“水解”是指通过酶促活性从含有半乳糖单元的低聚糖的非还原末端去除α-D-半乳糖苷残基。对于低聚糖来说，低聚糖的水解意味着该低聚糖的聚合度(DP)被降低了。所述聚合度的降低可以意味着该低聚糖被水解成一种更小的低聚糖，并且优选地意味着该低聚糖被完全水解成其单体半乳糖单元。
本文中使用的术语“底物”是指含有低聚糖的化合物或混合物，特别是低聚糖水苏糖、棉仔糖和毛蕊花糖。
本申请中具体记载的底物实例包括油料种子粉(即大豆饼粉、低芥酸菜子粉)，植物蛋白片、动物饲料和任何形式的人类食品。
大豆或黄豆被用作本发明底物的一种示范性来源，然而其它底物来源如低芥酸菜子、油菜籽、向日葵籽、亚麻籽、红花籽、芝麻籽和棉花籽也可以被用作本发明的底物来源。因此，在大豆方面所定义的术语如“粉”、“油”、“片”、“饲料”、“蛋白”和“产物”也适用于其它的底物来源。通常，合适的底物来源优选地是油料种子，然而本发明还适用于其它的底物来源。
本文中使用的术语“大豆产品”是任何可食用的或不可食用的、以大豆为天然来源的产品。因此，“大豆产品”可以包括大豆饼粉、大豆油、大豆片、粗大豆饼粉、大豆蛋白和蛋白浓缩物、大豆卵磷脂、大豆皮、大豆分离物或浓缩物、豆腐或任何含有大豆产品如大豆饼粉的动物饲料或人类食品。
通常，“大豆饼粉”被定义为一种从大豆中提取出大豆油后剩余的高蛋白残渣(通常含有40％以上的蛋白)。将大豆加工制成大豆饼粉的各种方法的实例如授予Ronai等的专利号为4,103,034的美国专利中所记载的方法，该专利公开的内容被全文引入本文作为参考。大豆饼粉是一种普通的且一般为优选的制备动物饲料的蛋白来源，并且可以是浸提或排出器提取的、完全或脱壳大豆饼粉，或者是通过本技术领域：
中已知的其它方法进行过加工的大豆饼粉。
“动物饲料”通常含有一种有机物质的混合物，该混合物包括至少一种蛋白源如油料种子粉(即，大豆饼粉)、至少一种碳水化合物源和其它组分如填充物、疏松物、添加的营养物质以及本文中进一步记载的其它成分。动物饲料在本技术领域：
中是已经熟知的并且包括高品质的蛋白质饲料以及其它蛋白质品质较低的饲料。饲料可以包括大豆饼粉、棉花籽粉、羽毛粉、血粉、青贮饲料、肉和骨粉、向日葵籽粉、低芥酸菜子粉、花生粉、红花粉、亚麻籽粉、芝麻粉、早期开花的豆荚、鱼类产品、副产品蛋白质饲料如烧酒糟和啤酒发酵糟、奶产品、家禽产品、干草、玉米、小麦、苜蓿、大麦、买罗高梁、高粱及其混合物。下面将进一步描述动物饲料中可能包含的其它成分。
B.嗜高温α-半乳糖苷酶的特性从嗜热微生物中分离出来的α-半乳糖苷酶(在本文中还被称作“嗜高温酶”或“嗜高温α-半乳糖苷酶”)被用于本发明。可以从中分离α-半乳糖苷酶的嗜热微生物包括细菌栖热菌属的菌种(即，嗜热栖热菌)和栖热袍菌属的菌种。优选的嗜高温微生物包括栖热袍菌属的菌种，包括海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种，其中海栖热袍菌是特别优选的。优选的被分离出来的α-半乳糖苷酶包括那些从海栖热袍菌DSM 3109和那不勒斯栖热袍菌5068，及其突变体或变异体中分离出来的α-半乳糖苷酶。参见例如W.Liebel等，系统应用微生物学(System.Appl.Microbiol).21，1-11(1998)和G.Duffaud等，环境应用微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63,169-177(1997)。
采用本技术领域：
中已知的和本文中记载的技术可以从嗜高温微生物中分离出α-半乳糖苷酶。在G.Duffaud等，环境应用微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63,169-177(1997)中也记载了如何从嗜高温微生物中分离所述的酶。如本发明所使用的，α-半乳糖苷酶可以是天然的、合成的、半合成的或重组的。在一个优选的实施方案中，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶可由一种分离的多核苷酸来编码，其一种优选的实施方案是具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的cDNA。
本发明的酶可以是一种天然纯化产物，或一种化学合成产物，或通过重组技术由原核或真核宿主(例如，由细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞培养物)来制备，下面将更加详细地进行描述。根据重组制备过程中使用的宿主，本发明的酶可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的酶可以含有也可以不含初始蛋氨酸残基。
本发明的酶具有活性的最嗜中温度将随着每种酶和最初从其中分离该酶的每种微生物的不同而改变。
通常，本发明的酶在约75℃以上的温度下具有活性，更优选地是在约80℃以上，以及最优选地是在约85℃以上的温度下具有活性。
本发明的酶可以在高至90℃或甚至高至100℃的温度下仍具有活性。在一个最优选的实施方案中，本发明的酶在正常环境或室温(即，约25℃)下几乎或完全不具有活性。通常，本发明的酶在其最嗜中温度下具有最大的半衰期，所述最嗜中温度通常在约80℃至98℃范围内，更优选地在约85℃至98℃范围内。尽管这些酶在这些温度下的半衰期通常比较短，但是这些酶通常在100℃下仍具有活性。
本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶在具有可变的和宽范围的含水量的环境下具有活性。例如，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶在约70％、约45％、约25％的含水量，甚至含水量更低的条件下具有活性。
技术人员知道利用“定向进化”或代谢工程技术，例如授予Minshull等的美国专利US5,837,458、授予Ladner等的美国专利US5,837,500和授予Stemmer等的美国专利US5,811,238中所述的技术可以将本发明酶的有用变体设计成针对特定底物或条件具有最适活性，所述专利的全部公开内容被引入本文作为参考。
C.嗜高温α-半乳糖苷酶的制备在一个实施方案中，可以按照本技术领域：
中的已知技术从天然嗜高温微生物分离并且任选地纯化嗜高温α-半乳糖苷酶。在G.Duffaud等，应用环境微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63，169-177(1997)中可以找到如何从天然嗜高温微生物分离天然存在的嗜高温α-半乳糖苷酶及其合适的条件和试剂的示范性描述。
在另一个实施方案中，克隆和表达了一种编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸(优选地，DNA)来制备本发明使用的酶。然后所表达的蛋白被分离出来并被用于本发明的方法和化合物中。尽管所述酶能以非纯化或部分纯化的形式被用于本发明的方法中，但可以任选地对以这种方式制备的嗜高温酶进行纯化。
用来表达α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列可以是基因组来源的，cDNA，或合成来源的，或其任意组合。所述多核苷酸序列还可以通过常规方法来进行克隆，所述常规方法包括在合适的载体中，克隆来源于任意嗜高温α-半乳糖苷酶产生菌株的cDNA文库；用所述载体转化合适的宿主细胞；在适当的条件下培养所述宿主细胞以便表达由所述cDNA文库中的克隆编码的酶；通过检测由这种克隆产生的酶的嗜高温α-半乳糖苷酶活性来筛选阳性克隆；然后从这类克隆中分离编码所述酶的DNA。
用来表达α-半乳糖苷酶的多核苷酸可以按照已知操作步骤，利用合成的寡核苷酸探针，通过杂交方便地由任何产生嗜高温α-半乳糖苷酶的微生物来克隆，所述寡核苷酸探针是在SEQ ID NO1所示的DNA序列或其任意合适的亚序列的基础上、或在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基础上制备的。或者，所述DNA序列可以通过利用在本文所公开的DNA序列的基础上制备的PCR引物来进行克隆。
如上所述，本发明采用了分离的以及任选纯化的嗜高温α-半乳糖苷酶。这种蛋白可以根据已知技术从表达该蛋白的宿主细胞中分离，或者甚至通过合成来制备。本发明的核酸，含有该核酸的构建物以及表达被编码蛋白的宿主细胞可用来制备本发明的酶。
特定起始信号也可被用来使编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列进行更有效的翻译。这种信号包括起始密码子和相邻序列。如果将编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列、其起始密码子和上游序列插入适当的表达载体中，则可以不需要附加的转录或翻译调控信号。然而，如果只插入了编码序列或其片段，则应当提供包括起始密码子在内的外源翻译调控信号。而且，所述起始密码子应当处于正确的读框中从而确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是多种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。所述表达效率可以通过包含增强子来提高，所述增强子适合于所使用的特定细胞系统，如文献中所记载的那些增强子。参见例如D.Scharf等，Results Probl.Cell Differ.20，125-162(1994)。
本发明编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸包括那些编码与本文公开的蛋白同源且生物学特性基本相同的蛋白的多核苷酸，特别是本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA以及编码本文提供的如SEQ IDNO2所示的嗜高温α-半乳糖苷酶的DNA。该定义旨在包括其天然的等位序列。因此，与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA(或其如下所述的被用作杂交探针的片段或衍生物)杂交的并且通过表达编码本发明蛋白(例如SEQ ID NO2所示的蛋白)的多核苷酸也可用来实施本发明。
可以按照已知技术来确定允许通过表达编码本发明蛋白的其它多核苷酸与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA进行杂交的条件。例如，在一种标准杂交试验中，这些序列与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA的杂交可以在低严格性、中严格性的条件或甚至在严格条件(例如，分别由在37℃下35-40％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、0.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件；由在42℃下40-45％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、0.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件；和由在42℃下50％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、O.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件)下进行。通常，编码本发明蛋白并且与本文公开的由SEQ ID NO1所示DNA杂交的序列与SEQ IDNO1分别具有至少75％的同源性，85％的同源性，甚至95％的同源性或者更高的同源性。而且，编码本发明蛋白的多核苷酸，或者与SEQID NO1所示DNA杂交的、但由于遗传密码的简并性密码子序列不同于SEQ ID NO1的多核苷酸也可用来实施本发明。在文献中已知遗传密码的简并性允许不同核酸序列编码相同的蛋白或肽。例如参见授予Toole等的美国专利US4,757,006的第2栏、表1。
尽管编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其变体的核苷酸序列优选地能够在适当选择的严格性条件下与天然存在的嗜高温α-半乳糖苷酶的核苷酸序列杂交，但是有利地是制备嗜高温α-半乳糖苷酶或其具有基本上不同的密码子选择的衍生物。可以对密码子进行选择从而增加肽在特定的原核或真核宿主中的表达速率，以使该表达速率与所述宿主利用特定密码子的频率一致。基本上改变编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其衍生物的核苷酸序列而不改变被编码的氨基酸序列的其它前提包括制备与由天然存在的序列制备的转录物相比具有更理想特性如更长半衰期的RNA转录物。
本发明还包括完全通过化学合成的方法制备编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其衍生物的DNA序列或其片段。制备完毕后，可以利用本技术领域：
中熟知的试剂将合成的序列插入到多种可利用的表达载体和细胞系统的任一种中。而且，化学合成方法可被用来将突变引入到一种编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列或其任何片段中。
如本文中公开的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列可被用来制备与本发明的多核苷酸(即，cDNA)或与mRNA发生特异性结合的杂交探针以便确定本发明的蛋白是否发生了扩增或过量表达。
通过遗传工程技术制备克隆基因、重组DNA、载体、被转化的宿主细胞、蛋白和蛋白片段是已知的。例如参见授予Bell等的美国专利US 4,761,371，第6栏第3行至第9栏第65行；授予Clark等的美国专利US 4,877,729，第4栏第38行至第7栏第6行；授予Schilling的美国专利US 4,912,038，第3栏第26行至第14栏第12行和授予Wallner的美国专利US 4,879,224，第6栏第8行至第8栏第59行。(申请人明确表示本文引用的所有专利参考文献中公开的全部内容被引入本文作为参考)。
载体是一种可复制的核酸(优选地是DNA)构建物。载体被本发明用来扩增编码本发明所述蛋白的DNA或表达本发明的蛋白。表达载体是一种可复制的核酸构建物，在该构建物中编码本发明所述酶的核酸序列与合适的控制序列进行可操作性连接，该控制序列能够实现本发明所述酶在一种合适宿主中的表达。对这类控制序列的需要将随着所选宿主和所选转化方法而变化。控制序列一般包括转录启动子、任选的控制转录的操纵基因序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。总之，所需要的是在宿主中的复制能力，通常是由复制起点所赋予的，以及一个便于识别转化体的选择基因。
载体包括但不限于质粒、病毒(例如，腺病毒、巨细胞病毒)、噬菌体、反转录病毒和能够整合的DNA片段(即，通过重组能够整合到宿主基因组中的片段)。所述载体能够独立于所述宿主基因组来进行复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合到所述基因组当中。表达载体优选地含有一个启动子和与需要表达的基因进行可操作性连接的RNA结合位点且可在宿主微生物中具有可操作性。
当核酸区域之间功能相关时，它们之间进行可操作性地连接或可操作性地结合。例如，如果一个启动子控制编码序列的转录，那么它就与该序列进行可操作性的连接；如果为了进行翻译而将核糖体结合位点定位，那么核糖体结合位点就与一个编码序列进行可操作性的连接。通常，可操作性的连接意味着连续的，对于前导序列是连续的并且是在读框内。
被转化的宿主细胞是指那些被含有本发明编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸的载体转化或转染的细胞，该细胞不必须，但优选地表达嗜高温α-半乳糖苷酶。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母细胞或高等真核生物细胞。
原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌(E.Coli)或芽孢杆菌，其中E.Coli是优选的。E.Coli通常被最初来源于pBR322(参见Bolivar等，基因2，95(1977))的质粒或源于该质粒的载体所转化。
表达载体优选地含有一个被所述宿主细胞识别的启动子。这通常，尽管不一定，是指从目的宿主中获得的启动子。所述启动子和SD序列(用于原核宿主的表达)可操作性地与本发明的DNA进行连接，即，它们被定位以便促进由该DNA开始进行信使RNA的转录。在本发明中，优选的启动子包括已知的λPL、T7和Pm启动子。通常用于重组微生物表达载体的其它启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，自然(Nature)275，615(1978)；和Goeddel等，自然(Nature)281，544(1979)；色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，核酸研究(Nucleic Acids Res).8，4057(1980)和EPO公开号为36,776的专利申请)；和tac启动子(H.De Boer等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80，21(1983)。尽管上述启动子是常用的，但其它的微生物启动子也是合适的。已经公开了许多有关核苷酸序列的详细内容，使得技术人员能够将有关核苷酸序列与质粒或病毒载体中编码蛋白质的DNA可操作性地连接在一起(Siebenlist等，细胞(Cell)20，269(1980))。
真核微生物如酵母培养物也可以被适当的编码嗜高温α-半乳糖苷酶的载体所转化。参见美国专利US 4,745,057。在低等真核宿主微生物中，最常用的是啤酒糖酵母，尽管一些其它的菌株通常也可使用。酵母载体可以含有一个源于2微米的酵母质粒或自主复制序列(ARS)的复制起点、一个启动子、编码所需蛋白的DNA、用于聚腺苷酸化和转录终止的序列和一个选择基因。一个质粒的实例是YRp7，(Stinchcomb等，自然(Nature)282，39(1979)；Kingsman等，基因(Gene)7，141(1979)；Tschemper等，基因(Gene)10，157(1980))。该质粒含有trp1基因，从而提供了一种用于不具有利用色氨酸进行生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，遗传学(Genetics)85，12(1977)。然而酵母宿主细胞基因组中的trp1被破坏后能够提供一种通过在没有色氨酸存在的条件下进行生长来检测转化的有效环境。
酵母载体中的合适的启动序列包括金属硫蛋白的启动子、3-磷酸-甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化学杂志(J.Biol.Chem).255，2073(1980)或其它糖酵解酶(Hess等，酶调节进展杂志(J.Adv.EnzymeReg).7，149(1968)；和Holland等，生物化学(Biochemistry)17，4900(1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。用于酵母表达的合适载体和启动子被进一步记载在R.Hitzeman等，EPO公开号73,657中。
源于多细胞生物的细胞培养物也可被用于重组蛋白的合成。原则上，任何高等真核细胞培养物都是可以使用的，不管是来源于脊椎动物还是来源于包括昆虫细胞在内的无脊椎动物培养物。这种细胞在细胞培养物中的繁殖成为一种常规过程。参见组织培养(TissueCulture)(学术出版社(Academic Press)，Kruse和Patterson，编辑)(1973)。用于这种细胞的表达载体通常包括(如果需要)一个复制起点、一个位于待表达基因上游的启动予以及一个核糖体结合位点、RNA剪接位点(如果使用了含有内含子的基因组DNA)、一个聚腺苷酸化位点和一个转录终止序列。
宿主细胞如昆虫细胞(例如，被培养的草地夜蛾细胞)和表达载体如杆状病毒表达载体也可被用来制备用于实施本发明的蛋白，如授予Smith等的美国专利US 4,745,051和US 4,879,236。一般来说，杆状病毒表达载体含有一个杆状病毒基因组，该基因组含有被插入到多角体蛋白基因的一个位点中的待表达基因，所述位点的范围是从多角体蛋白的转录起始信号至ATG起始位点并且处于杆状病毒多角体蛋白启动子的转录控制之下。
另外，可以选择一种能够调控被插入序列的表达或能够以所需方式对所表达的蛋白进行加工的宿主细胞菌株。蛋白多肽的这种修饰包括，但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。对“前原”形式的蛋白进行裂解的翻译后加工也可被用来促使正确的插入、折叠和/或发挥功能。具有特定细胞结构和特定翻译后作用机制的不同宿主细胞(例如，CHO，HeLa，MDCK，HEK293和WI38)可从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Bethesda，Md.)得到并且可被选择用来确保外源蛋白的正确修饰和加工。
为了长期、高产率地制备重组蛋白，稳定的表达是优选的。例如，能够稳定表达嗜高温α-半乳糖苷酶的细胞系可以被在同一个或不同载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件以及一个选择性标记基因的表达载体所转化。引进了所述载体后，在被转移到选择性培养基中之前，可以将细胞在富集培养基中培养1-2天。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在使得成功表达被引进序列的细胞得到培养和回收。被稳定转化的细胞的抗性克隆可以利用适合于细胞类型的组织培养技术进行增殖。
被编码嗜高温α-半乳糖苷酶的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于表达以及从细胞培养物中回收蛋白的条件下进行培养。由被转化细胞产生的酶根据所使用的序列和/或载体可以被分泌出来或被含在胞内。正如本技术领域：
的技术人员所能理解的，含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸的表达载体可以被设计成含有指导嗜高温α-半乳糖苷酶通过原核或真核细胞膜进行分泌的信号序列。其它构建可以被用来连接编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列与编码有利于可溶性蛋白进行纯化的多肽结构域的核苷酸序列。
通过利用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化所述酶。如果需要，在建立成熟蛋白构型的过程中可以利用蛋白重折叠步骤。最后，高效液相色谱(HPLC)可以被用于最终的纯化步骤。
通常，本技术领域：
的技术人员知晓可以对本发明肽的氨基酸序列进行较少的删除或取代而不会降低其活性。因此，含有这种缺失或取代的肽也属于本发明的一个方面。在含有置换或取代的氨基酸的肽中，肽序列中的一个或多个氨基酸可以被一个或多个其它氨基酸所取代，其中这种取代不影响所述序列的功能。这种变化可以根据氨基酸之间在物理特性如电荷密度、疏水性/亲水性、大小和构型方面的已知相似性来进行，从而使得氨基酸被功能特性基本相同的其它氨基酸所取代。例如Ala可以被Val或Ser取代；Val可以被Ala，Leu，Met或Ile取代，优选地被Ala或Leu取代；Leu可以被Ala，Val或Ile取代，优选地被Val或Ile取代；Gly可以被Pro或Cys，优选地被Pro所取代；Pro可以被Gly，Cys，Ser，或Met取代，优选地被Gly，Cys或Ser取代；Cys可以被Gly，Pro，Ser或Met取代，优选地被Pro或Met取代；Met可以被Pro或Cys取代，优选地被Cys取代；His可以被Phe或Gln取代，优选地被Phe取代；Phe可以被His，Tyr或Trp，优选地被His或Tyr取代；Tyr可以被His，Phe或Trp取代，优选地被Phe或Trp取代；Trp可以被Phe或Tyr取代，优选地被Tyr取代；Asn可以被Gln或Ser取代，优选地被Gln取代；Gln可以被His，Lys，Glu，Asn，或Ser取代，优选地被Asn或Ser取代；Ser可以被Gln，Thr，Pro，Cys或Ala取代；Thr可以被Gln或Ser，优选地被Ser取代；Lys可以被Gln或Arg取代；Arg可以被Lys，Asp或Glu，优选地被Lys或Asp取代；Asp可以被Lys，Arg或Glu取代，优选地被Arg或Glu取代；以及Glu可以被Arg或Asp取代，优选地被Asp取代。一旦进行了改变，就可以按照常规筛选方法来确定这些改变对酶功能的影响。
除了重组制备的方法外，嗜高温α-半乳糖苷酶的片段可以通过利用固相技术(J.Merrifield，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc).85，2149-2154(1963))进行定向肽合成来制备。通过手工技术或通过自动化方法可以进行蛋白质合成。例如，利用应用生物系统431 A肽合成仪(Perkin Elmer)可以进行自动化合成。可以分别化学合成嗜高温α-半乳糖苷酶的各种片段然后利用化学方法进行连接从而制备出全长分子。
D.利用嗜高温α-半乳糖苷酶的方法和组合物被分离的α-半乳糖苷酶被用于含半乳糖的低聚糖和含该低聚糖的化合物、底物和复杂混合物的水解反应中。
通过本发明的α-半乳糖苷酶水解的低聚糖包括但不限于棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖和PNP-半乳糖。
在优选的实施方案中，本发明的α-半乳糖苷酶被用于制备动物饲料。动物包括哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物，其中哺乳动物和鸟类是特别优选的。当动物是哺乳动物时，家畜是优选的，包括牛、猪、马和羊。当动物是鸟类时，优选的动物是鸡和火鸡。当动物是鱼类时，优选的动物是鲶鱼。
动物饲料(例如，鸡和其它家禽饲料，家畜饲料，家养动物饲料)通常通过混合不同的成分或组分来制备，所述成分或组分(即“活性成分”)被发现有必要与必需载体物质混合以便提供所需形式的饲料。所述饲料或饲料成分可以是任何需要的成分，优选地包括蛋白和碳水化合物。活性成分的选择取决于营养价值或取决于某些通过所述成分的活性获得的特性。酶或蛋白、氨基酸、色素、维生素、抗氧化剂、抗生素、着色剂和类胡萝卜素也可以被添加到所述饲料中。显然，这些成分的混合物可以同时加入或者连续加入。
动物饲料中的蛋白成分优选地以某种蛋白粉(即大豆饼粉)的形式加入。蛋白粉的合适形式如上所详述。蛋白源的其它实例包括单细胞蛋白或蛋白水解物如来源于酵母、藻类或细菌的蛋白水解物；被分离的动物蛋白、肽或蛋白水解物如血红蛋白、肌球蛋白、血浆或其它血清蛋白、胶原、酪蛋白、白蛋白或角蛋白的水解物；复杂蛋白源或蛋白水解物如奶、血、乳清、血粉、肉粉、羽毛粉、鱼粉、肉和骨粉、家禽副产品、家禽副产品粉、孵化副产品、禽蛋副产品、蛋白、蛋黄和无壳蛋的水解物；植物蛋白或蛋白水解物如分离的大豆蛋白、小麦蛋白、麦胚、烤酒糟和谷蛋白的水解物。在本发明的一个优选实施方案中，所述的动物饲料的蛋白源是一种植物蛋白源，在一个更优选的实施方案中，蛋白源是是大豆，任何可用形式的大豆包括大豆饼粉、大豆片、粗大豆饼粉等。
含在动物饲料中的碳水化合物为动物提供了一种营养源，另外能够有助于形成固体饲料。有用的碳水化合物包括玉米面粉、土豆淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、纤维素、果胶、琼脂糖和树胶；生物可利用的糖如葡萄糖、果糖和蔗糖；化学改性淀粉如改性玉米淀粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素和糊精；湿润剂如甘油或丙二醇；转化糖；和磨碎的改性碳水化合物如玉米、大米、燕麦、大麦、小麦、高粱、黑麦、小米、木薯、黑小麦和木薯，它们以完整的、磨碎的、粉碎的、磨成粉的、碾压的、挤压的、制粒的、脱脂的、脱水的、浸提的或其它的加工形式存在。
所述动物饲料可以且优选地确实含有水分(即，水)和组合物成分。在一个实施方案中，所述动物饲料可以由一种含有溶解在水中的树胶的胶体溶液来制备。可以用于此目的的树胶通常是植物或动物源的高分子量的分子，通常具有胶体特性，其在适当的溶剂中能够产生凝胶，所述分子是如琼脂、褐藻胶和来源于海藻的角叉菜胶、植物渗出物如阿拉伯树胶、加贴胶和黄芪胶、植物提取物如果胶、植物种子如瓜尔豆、角豆荚、和动物渗出物如血浆、血清白蛋白、卵清蛋白、壳多糖和明胶。其它树胶包括直链淀粉和支链淀粉以及细菌源的树胶。
所述动物饲料优选地抗微生物生长。即，如果处理得当，通过密封和在室温下持续贮存至少约八个星期，所述动物饲料没有出现长菌现象。例如通过灭菌、向饲料中加入微生物生长抑制剂如对羟基苯甲酸甲酯或一种山梨酸酯或调节所述饲料混合物的pH来稳定所述饲料。
为了增加适于某些应用如长期饲养的营养价值，所述饲料优选地含有一种氨基酸源如蛋白质、氨基酸、氨基酸前体或类似物，及其混合物。氨基酸的实例是必需氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸。氨基酸前体的实例是例如由Novus International(St.Louis，Mo.)销售的、商标为Aliment的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸，以及2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的盐如其钙盐和钠盐。
尽管对于某些应用不是优选的，但是所述饲料还可以包括较低比例的脂肪或脂类。合适的脂肪包括脂肪酸如亚油酸；分离的植物油如向日葵、红花、大豆、花生、低芥酸菜子、玉米、油菜籽、橄榄、亚麻籽和棕榈的油；脂肪粉如棉籽、花生、油菜籽、棕榈粉和坚果粉；和动物源的脂肪如蛋黄、猪油、黄油、家禽脂肪、牛羊脂和鱼油。
所述动物饲料还可以含有维生素和矿物质。维生素添加剂可以选自，例如，维生素A、B12、生物素、胆碱、叶酸、烟酸、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺、C，D，25-羟基D，E和K。矿物添加剂可以选自，例如，钙、磷、硒、氯、镁、钾、钠、铜、碘、铁、锰、和吡啶甲酸铬(chromium piccolinate)。
所述动物饲料还可以含有其它的非-α半乳糖苷酶如作用于其它种类化合物如蛋白、非淀粉多糖、脂类等的水解酶。授予Ivey等的美国专利5,985,336中列举了更全的可被本发明利用的酶、激素、抗生素、着色剂、稳定剂、氨基酸源和酶，该专利公开的全部内容被引入本文作为参考。
动物饲料组分(例如，大豆饼粉)和动物饲料本身的加工可以包括几个在高温(即，60℃以上，70℃以上或甚至80℃以上)下实施的步骤。具体地，可以在加工过程中对动物饲料的组分进行蒸汽处理从而，例如，除去溶剂或者“蒸煮”所述粉以获得一定的营养特性。通常，所述动物饲料的加工终止于使所述饲料形成颗粒或其它动物食用所需形式的挤压或成形工艺。所需形式可以是粉末、颗粒、溶液或悬浮液。优选的形式取决于应用条件、组成和向最终用户目的地运输的方法。
在本发明中，本文记载的嗜高温α-半乳糖苷酶可以在例如大豆、其它豆类、豆荚、玉米、小麦、燕麦、甜菜、低芥酸菜子、稻米或其它谷物或蛋白源的去壳或去皮后的饲料或粉的加工，一直到并且包括动物饲料的制粒或挤压过程中的任意时候被添加到所述的动物饲料中。在本发明中，例如，可以在混合所述饲料的各种成分时加入所述嗜高温α-半乳糖苷酶。唯一对饲料加工过程中嗜高温α-半乳糖苷酶加入时机的限制是所述酶必须在进行高温(即，高于约60℃、70℃、75℃或80℃)加工步骤之前加入。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶在进行加工过程中对动物饲料成分或动物饲料进行蒸汽处理之前加入。
所述嗜高温α-半乳糖苷酶能以包括液体形式(即，所述酶处于溶液或培养物中)或干粉形式在内的任何合适的形式被加到动物饲料成分或动物饲料中。如果以干燥形式加入，嗜高温α-半乳糖苷酶可以是被喷雾干燥的、冻干的、冷冻干燥的或通过本技术领域：
中已知的其它合适的加工方法干燥的。
嗜高温α-半乳糖苷酶能以粗制形式、部分纯化形式、基本纯化形式或纯化形式被加入。
在饲料加工过程中加入嗜高温α-半乳糖苷酶提供了某些超过现有技术的优势。所述嗜高温α-半乳糖苷酶在动物饲养加工过程中采用的高温下具有活性。因此，解除了只能在制粒或挤压工艺后才能应用所述酶的需要。用嗜高温α-半乳糖苷酶处理后，所述动物饲料仍然保留半乳糖和蔗糖单体作为动物的可利用和可消化的能源。由于抗营养因子(即，不可消化的低聚糖)通过所述酶被去除了，因此由于半乳糖和蔗糖的可利用性的提高而增加了能量值，并且也增加了蛋白的利用率。最终，所述酶在动物消化所述饲料前具有活性，因而保证了动物能够利用由分解低聚糖带来的任何营养优势。
在本发明的另一个实施方案中，嗜高温α-半乳糖苷酶被用作人类食品的食品添加剂。本发明利用嗜高温α-半乳糖苷酶的优势在于所述酶的高温活性。即，由于通过蒸煮或加热而施加给所述食品的高温能够激活所述酶，所以酶可在制作如蒸煮之前被加到食品中。在这个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶在食品包装前被加到食品中(例如加到待加热的大豆奶中)，或者在蒸煮前被加到食品上。嗜高温α-半乳糖苷酶分解不可消化的低聚糖的活性由此能够减轻如上所述的胃肠病痛。
当被用作食品添加剂时，嗜高温α-半乳糖苷酶能以包括液体或粉末在内的几种形式中的任一种来使用。粉末形式的酶可以被包装在或保存在一种“盐-摇筛”或其它类型的粉末分配器中，所述粉末可以在蒸煮前被喷洒在食品上。粉末形式的嗜高温α-半乳糖苷酶可以与一种或多种也可以是粉末或干燥形式的赋形剂混合。可以与一种食品级的α-半乳糖苷酶混合的干燥成分的代表性实例包括但不限于葡萄糖、磷酸二钙、微晶纤维素、改性纤维素和改性淀粉。这些赋形剂可从已知商业来源获得。选择这些赋形剂的标准是除了能够作为α-半乳糖苷酶的可摄取的非毒性载体外，还要具有适口性和易流动性。
液体形式的所述酶可添加到瓶装、罐装或其它容器装的食品中。被浓缩的(高纯度的)液体α-半乳糖苷酶可以通过采用一种溶剂如水溶解或混合一种干燥或粉状的酶来制备。所述液体形式的酶可以利用其它合适的稀释液体或赋形剂来稀释。稀释度取决于使用目的。液体赋形剂的代表性实例包括，但不限于水、甘油和山梨醇。用于选择合适的液体赋形剂的标准可包括可混溶性、稳定性和适口性。
在本发明的另一个实施方案中，嗜高温α-半乳糖苷酶可被用作在制备可食用的植物蛋白产品(本文中还被称作可食用的蛋白分离物或可食用的蛋白浓缩物)如可食用的大豆蛋白产品的过程中使用的加工添加剂。具体地，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶可帮助从蛋白产品中去除不需要的低聚糖和半乳糖单体，因此使得制备的植物蛋白产品部分、基本或完全不含半乳糖或低聚糖组分。
制备分离的大豆蛋白和其它植物蛋白的方法是已知的。例如参见授予Johnson等的美国专利US 5,936,069以及网址www.centralsoya.com.由于营养原因，从分离的大豆产品中去除低聚糖或碳水化合物有时是需要的。目前从蛋白分离物中除去低聚糖的方法通常是耗时的、昂贵的和困难的。
以分离的大豆蛋白的加工作为实例，在本发明的方法中，在可食用大豆蛋白的加工过程中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被加到大豆底物(例如，一种大豆片混合物)中。将含有大豆底物和嗜高温α-半乳糖苷酶的混合物加热到如上文所述的嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，并且保持足够长的时间以便使所述大豆混合物中的低聚糖水解。可以在除去大豆底物中的油之前或之后加入嗜高温α-半乳糖苷酶，但是优选地在提取或进一步纯化分离形式的大豆蛋白之前加入。一旦被水解，就可以通过本技术领域：
中已知的方法从离析大豆蛋白中除去低聚糖，如通过采用水或含水乙醇进行冲洗或通过等电沥滤来从被分离的大豆蛋白中除去低聚糖。因而，可以制备出来源于大豆加工的部分或完全缺乏含半乳糖的低聚糖的可食用植物蛋白产品。通过这种方式，可以减轻或防止离析大豆蛋白食用者的如上所述的胃肠病痛，因为不希望有的低聚糖已从离析大豆蛋白中除去。
下列实施例被提供用来说明本发明，而不应当被理解为对本发明的限制。
实施例1Tm galA的克隆和表达通过PCR从基因组制备的Tm全长DNA中克隆Tm galA。35个循环后，得到了长度约为1.65kb的单一PCR产物。与由公开的DNA序列产生的限制图谱相比，利用BamHI、XhoI、NdeI、KpnI和HindIII的限制图谱产生了正确的带型和正确大小的DNA片段。SEQ ID NO1表示GenBank数据库中公开的Tm galA核苷酸序列(登记号2660640)。该序列被用来制备用于克隆该基因PCR引物。
在以pET24d+作为表达载体(Novagen，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA)的大肠杆菌BL21(λDE3)中表达Tm galA。在对弗氏压榨细胞提取物进行热处理(80℃，30分钟)后，从4L培养物中回收到大约330个单位的可溶性Tm GalA活性(1个单位的酶活性被定义为每分钟从PNP-半乳糖中释放1μmol PNP所需的酶量)。在12％的SDS-PAGE凝胶上清楚地辨别出一条约64kDa的蛋白带。该条带对应于如以前W.Liebl等，系统应用微生物(System.Appl.Microbiol).21，1-11(1998)中所述的Tm GalA的单一单体。
实施例2Tm GalA活性采用在405nm下测定10分钟后释放游离PNP的终点测定法以PNP-半乳糖为底物测定温度和pH的最适值。简单地说，就是在1mL的分析物中含有1mM PNP-半乳糖和用含1mM NaCl的50mM醋酸钠缓冲液适当稀释的酶。10分钟后，通过加入100μl的1M Na2CO3并将该反应混合物置于冰上来终止反应。图1和图2表示分别作为pH和温度的函数的酶百分比活性。从这些图中可以清楚地看到所述反应的最适值为大约4.5的pH和85℃的温度。
如表1所示，随着底物的聚合度(DP)升高，Tm GalA活性降低。以PNP-半乳糖为底物时Tm GalA的活性达到最大值，而以棉子糖(DP3)为底物时，Tm GalA的活性则降低了约2.5倍，以及以水苏糖(DP4)和毛蕊花糖(DP5)为底物时，Tm GalA的活性则降低了20倍。从水苏糖至毛蕊花糖预计还可以观察到比活性的进一步降低。然而，在所采用的测定技术(Somogyi-Nelson技术)的误差范围内，无法观察到这一现象。Somogyi-Nelson技术可分析总还原糖的产生。因此，由毛蕊花糖或水苏糖释放的半乳糖与从毛蕊花糖中去除了半乳糖的产物之间无法进行区别。
表1.Tm GalA比活性
实施例3鸡饲料的Tm GalA消化在对所述饲料的直接酶促处理过程中和对再溶解的乙醇提取的组分进行处理时表明了Tm GalA消化可溶性鸡饲料组合物的正效应。乙醇提取法提供了一种通过从所述饲料基质中提出饲料的水溶性碳水化合物部分来对Tm GalA消化鸡饲料组分进行更加详细分析的方法。通过这种技术提取的碳水化合物通常被限制到DP＜8。采用250mL的80％的沸腾乙醇完全回流2小时来对25g的饲料进行提取。通过蒸发乙醇，留下桔黄色的残渣。在混合5分钟和在85℃下加热30分钟后，该残渣可以被部分溶解在10倍体积的水(w/v)中。可溶性部分的HPLC分析结果表明在约37，42和46分钟时具有三个不同的峰。基于与已知标准进行比较的保留时间可以将约37和42分钟时出现的峰分别推定为水苏糖和蔗糖。采用15个单位的Tm GalA对可溶性部分处理1小时后，可以观察到‘水苏糖’峰完全消失了。该特定实验中的水苏糖的初始浓度估计约为5.6mM。除了水苏糖的消失，在约47分钟时可以观察到半乳糖峰的出现，同时伴随着蔗糖峰从t＝0时的4.77×107面积计算值增加到一小时后的5.44×107面积计算值。
采用50个单位的Tm GalA直接处理饲料(100mg ml-1)产生了与对提取可溶性的部分进行消化的结果相似的结果。在这些实验中，在加入所述酶之前，将饲料在98℃下预加热2小时。同前面的研究相同，在头一个小时内，可以观察到在HPLC色谱中的水苏糖峰完全消失的同时伴随着半乳糖峰的出现。
实施例4温度和含水量对Tm GalA消化大豆饼粉和大豆片的影响表2说明了温度对Tm GalA直接消化大豆饼粉和大豆片的影响。利用4克大豆饼粉或大豆片、50U的α-Gal/500mg的粉或片和70％的含水量进行实验。在表2列出的温度下将所述大豆饼粉/片-α-Gal混合物总共温育45分钟。在实验过程中，以5分钟的间隔将所述混合物的样品放置在冰上，然后即刻用80％的乙醇进行提取并按照实施例3中的记载进一步进行加工。然后通过HPLC分析重新悬浮的部分。可以将在约35、39和42分钟时出现的峰分别确定为水苏糖、棉子糖和蔗糖。将麦芽六糖或麦芽五糖用作内标。对各时间点的剩余水苏糖和棉子糖浓度进行线性回归从而得出表2中的比率。从所示数据可以看出，随着温度降低，水苏糖和棉子糖从所述粉或片中的去除率也降低了。这可以给出所述酶的温度/活性的变化曲线。
表2.随温度的不同而变化的低聚糖去除率a，b
a在70％的过量含水量的条件下采用单位U的α-Gal进行的实验b每分钟每克物质每单位α-Gal低聚糖的去除率(％)c括号中的数字表示给定实验的R2值。
表3显示了含水量对TmGalA直接消化大豆饼粉和大豆片的影响。除了温度被固定在90℃以及含水量的变化如表3所示外，按照与上述相似的条件进行实验。在90℃下进行温育前，通过在真空和45℃下对大豆饼粉/大豆片-α-Gal混合物进行温育直到获得适当的含水量来实现含水量的变化。该处理完成后，如上所述进行实验。由表3中的数据可以明显看出含水量对a-Gal消化大豆饼粉和大豆片的比率影响并不显著，估计直到达到含水量的某一临界值才会有影响。
表3.随过量含水量的不同而变化的低聚糖去除率a，b
a在90℃下采用50单位的α-Gal进行的实验b每分钟每克物质每单位α-Gal低聚糖的去除率(％)c括号中的数字表示给定实验的R2值。
实施例5结果概述源于海栖热袍菌(Tm)DSM 3109的α-半乳糖苷酶(GalA)已被成功地克隆出来被初步定性。所述酶具有约4.5-5.0的最适pH和约85-90℃的最嗜中温度。所述酶对PNP-半乳糖、棉子糖(DP3)、水苏糖(DP4)和毛蕊花糖(DP5)具有活性。表1列出了Tm GalA相对各种底物的比活性。而且，所述酶在pH7和90℃的条件具有70分钟的半衰期，表明在饲料加工过程中经蒸汽处理后仍具有活性能力。另外，在25℃(pH4.5)下Tm GalA对PNP-半乳糖只显示出其最大活性的3％，表明室温下TmGalA对聚合度较高的棉子糖-低聚糖的活性可能最低。Tm GalA对高蛋白含量和高碳水化合物含量的鸡饲料的初始消化物产生了阳性结果。Tm GalA对被溶解的、乙醇提取的鸡饲料组分进行消化的结果表明所述酶能够从所述饲料中有效去除被认定是水苏糖的组分。还对从未加工的、未处理的鸡饲料中去除可溶性水苏糖进行了观察。
上述内容只是对本发明的说明而不意味着对本发明的限制。通过后续的权利要求
对本发明进行了限定，其中包括了所述权利要求
的等同内容。
序列表 110 Syngenta Participations AG 120 高温水解复杂混合物中的含半乳糖的低聚糖的方法 130 A-31512A 140
141
150 US 60/220,211 151 2000-07-22 160 2 170 PatentIn版本2.0 210 1 211 1659 212 DNA 213 海栖热袍菌 220
221 CDS 222 (1)..(1659) 400 1atg gaa ata ttc gga aag gcc ttc aga gag gga aga ttc gtt ctc aaa 48Met Glu Ile Phe Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu Lys1 5 10 15gag aaa aac ttc aca gtt gag ttc gcg gtg gag aag ata cac ctt ggc 96Glu Lys Asn Phe Thr Val Glu Phe Ala Val Glu Lys Ile His Leu Gly20 25 30tgg aag atc tcc ggc agg gtg aag gga agt ccg gga agg ctt gag gtt 144Trp Lys Ile Ser Gly Arg Val Lys Gly Ser Pro Gly Arg Leu Glu Val35 40 45ctt cga acg aaa gca ccg gaa aag gta ctt gtg aac aac tgg cag tcc 192Leu Arg Thr Lys Ala Pro Glu Lys Val Leu Val Asn Asn Trp Gln Ser50 55 60tgg gga ccg tgc agg gtg gtc gat gcc ttt tct ttc aaa cca cct gaa 240Trp Gly Pro Cys Arg Val Val Asp Ala Phe Ser Phe Lys Pro Pro Glu65 70 75 80ata gat ccg aac tgg aga tac acc gct tcg gtg gtg ccc gat gta ctt 288Ile Asp Pro Asn Trp Arg Tyr Thr Ala Ser Val Val Pro Asp Val Leu
85 90 95gaa agg aac ctc cag agc gac tat ttc gtg gct gaa gaa gga aaa gtg 336Glu Arg Asn Leu Gln Ser Asp Tyr Phe Val Ala Glu Glu Gly Lys Val100 105 110tac ggt ttt ctg agt tcg aaa atc gca cat cct ttc ttc gct gtg gaa 384Tyr Gly Phe Leu Ser Ser Lys Ile Ala His Pro Phe Phe Ala Val Glu115 120 125gat ggg gaa ctt gtg gca tac ctc gaa tat ttc gat gtc gag ttc gac 432Asp Gly Glu Leu Val Ala Tyr Leu Glu Tyr Phe Asp Val Glu Phe Asp130 135 140gac ttt gtt cct ctt gaa cct ctc gtt gta ctc gag gat ccc aac aca 480Asp Phe Val Pro Leu Glu Pro Leu Val Val Leu Glu Asp Pro Asn Thr145 150 155 160ccc ctt ctt ctg gag aaa tac gcg gaa ctc gtc gga atg gaa aac aac 528Pro Leu Leu Leu Glu Lys Tyr Ala Glu Leu Val Gly Met Glu Asn Asn165 170 175gcg aga gtt cca aaa cac aca ccc act gga tgg tgc agc tgg tac cat 576Ala Arg Val Pro Lys His Thr Pro Thr Gly Trp Cys Set Trp Tyr His180 185 190tac ttc ctt gat ctc acc tgg gaa gag acc ctc aag aac ctg aag ctc 624Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Trp Glu Glu Thr Leu Lys Asn Leu Lys Leu195 200 205gcg aag aat ttc ccg ttc gag gtc ttc cag ata gac gac gcc tac gaa 672Ala Lys Asn Phe Pro Phe Glu Val Phe Gln Ile Asp Asp Ala Tyr Glu210 215 220aag gac ata ggt gac tgg ctc gtg aca aga gga gac ttt cca tcg gtg 720Lys Asp Ile Gly Asp Trp Leu Val Thr Arg Gly Asp Phe Pro Ser Val225 230 235 240gaa gag atg gca aaa gtt ata gcg gaa aac ggt ttc atc ccg ggc ata 768Glu Glu Met Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Gly Phe Ile Pro Gly Ile245 250 255tgg acc gcc ccg ttc agt gtt tct gaa acc tcg gat gta ttc aac gaa 816Trp Thr Ala Pro Phe Ser Val Ser Glu Thr Ser Asp Val Phe Asn Glu260 265 270cat ccg gac tgg gta gtg aag gaa aac gga gag ccg aag atg gct tac 864His Pro Asp Trp Val Val Lys Glu Asn Gly Glu Pro Lys Met Ala Tyr275 280 285
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485 490 495tac gag atc gtc tcg tct ggc act ctc tca gga aac gtc aag atc gtg 1536Tyr Glu Ile Val Ser Ser Gly Thr Leu Ser Gly Asn Val Lys Ile Val500 505 510gtc gat ctg aac agc aga gag tac cac ctg gaa aaa gaa gga aag tcc 1584Val Asp Leu Asn Ser Arg Glu Tyr His Leu Glu Lys Glu Gly Lys Ser515 520 525tcc ctg aaa aaa aga gtc gtc aaa aga gaa gac gga aga aac ttc tac 1632Ser Leu Lys Lys Arg Val Val Lys Arg Glu Asp Gly Arg Asn Phe Tyr530 535 540ttc tac gaa gag ggt gag aga gaa tga 1659Phe Tyr Glu Glu Gly Glu Arg Glu545 550 210 2 211 552 212 PRT 213 海栖热袍菌 400 2Met Glu Ile Phe Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu Lys1 5 10 15Glu Lys Asn Phe Thr Val Glu Phe Ala Val Glu Lys Ile His Leu Gly20 25 30Trp Lys Ile Ser Gly Arg Val Lys Gly Ser Pro Gly Arg Leu Glu Val35 40 45Leu Arg Thr Lys Ala Pro Glu Lys Val Leu Val Asn Asn Trp Gln Ser50 55 60Trp Gly Pro Cys Arg Val Val Asp Ala Phe Ser Phe Lys Pro Pro Glu65 70 75 80Ile Asp Pro Asn Trp Arg Tyr Thr Ala Ser Val Val Pro Asp Val Leu85 90 95Glu Arg Asn Leu Gln Ser Asp Tyr Phe Val Ala Glu Glu Gly Lys Val100 105 110Tyr Gly Phe Leu Ser Ser Lys Ile Ala His Pro Phe Phe Ala Val Glu115 120 125Asp Gly Glu Leu Val Ala Tyr Leu Glu Tyr Phe Asp Val Glu Phe Asp
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权利要求
1.一种水解存在于底物中的含半乳糖的低聚糖的方法，该方法包括使所述底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；和将所述底物加热到嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，并保持足够长的时间从而使所述低聚糖发生水解。
2.如权利要求
1所述的方法，其中所述低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。
3.如权利要1所述的方法，其中所述底物选自动物饲料、大豆饼粉和人类食物。
4.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
5.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
6.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
7.如权利要求
1所述的方法，其中所述低聚糖被水解成半乳糖单体。
8.如权利要求
1所述的方法，其中所述方法在70％含水量的条件下进行。
9.如权利要求
1所述的方法，其中所述方法在25％含水量的条件下进行。
10.如权利要求
1所述的方法，其中所述加热在80℃、85℃、90℃或100℃下进行。
11.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
12.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
13.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
14.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
15.一种制备含有被水解的含半乳糖低聚糖的动物饲料组合物的方法，包括在动物饲料的加工过程中使所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，其中在所述动物饲料加工过程中的加热步骤之前使嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组分接触足够长的一段时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解含半乳糖的低聚糖。
16.如权利要求
15所述的方法，其中所述含半乳糖的低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。
17.如权利要求
15所述的方法，其中所述动物饲料包括大豆饼粉、大豆片或是鸡饲料。
18.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
19.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
20.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
21.如权利要求
15所述的方法，其中所述低聚糖被水解成半乳糖单体。
22.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶与动物饲料组合物的组分是在70％、25％或45％的含水量条件下进行接触的。
23.如权利要求
15所述的方法，其中所述加热步骤是在80℃、85℃、90℃或100℃下进行的。
24.如权利要求
15所述的方法，其中所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶是在动物饲料加工过程中的最后造粒步骤之前进行接触的。
25.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
26.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
26.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
27.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
28.如权利要求
15所述的方法，其中当所述嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组合物的组分进行接触时，所述嗜高温α-半乳糖苷酶是液体溶液的形式，干燥的形式、部分纯化或基本纯化的形式。
29.一种由权利要求
15所述的方法生产的动物饲料。
30.一种用于减轻哺乳动物胃肠病痛的食品添加剂，该食品添加剂含有一种嗜高温α-半乳糖苷酶。
31.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
32.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
33.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
34.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
35.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
36.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
37.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
38.一种预防哺乳动物胃肠病痛的方法，其中所述胃肠病痛由含有至少一种选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的低聚糖的食物所引起，所述方法包括使所述食物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；然后将所述食物加热足够长的时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解所述的低聚糖。
39.一种用于在可食用大豆蛋白的加工制作过程中去除含半乳糖的低聚糖的加工添加剂，该加工添加剂含有嗜高温α-半乳糖苷酶。
40.一种从被用来加工生产可食用大豆蛋白的大豆底物中去除含半乳糖的低聚糖的方法，包括使所述大豆底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；在一定温度下将所述大豆底物加热足够长的时间从而使所述含半乳糖的低聚糖发生水解；和在最终萃取或分级分离可食用大豆蛋白之前从所述大豆底物中去除被分解的含半乳糖的低聚糖。
41.如权利要求
40所述的方法，其中所述加热在从所述大豆底物中去除油之前进行。
42.如权利要求
40所述的方法，其中所述加热在从所述大豆底物中去除油之后进行。
43.如权利要求
40所述的方法，其中所述
本发明涉及利用嗜高温酶水解低聚糖来加工动物饲料和其它复杂底物的方法。
α-半乳糖苷酶(本文中也被称作α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC3.2.1.22，α-gal或Gal36)是一种外切作用糖苷酶，该酶催化从含单纯半乳糖的低聚糖的非还原末端水解α-1→6连接的α-D-半乳糖残基。这些低聚糖的实例包括棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖和蜜二糖，以及更复杂的多糖。
胞内和胞外的α-gal广泛分布于微生物、植物和动物体内。编码α-gal的基因已被从包括人、植物、酵母、丝状真菌和细菌在内的多种来源中克隆出来。基于一级结构的相似性和疏水簇分析，按照糖基水解酶的常规分类方法已经将α-gal分为三个高度保守的家族。来源于细菌的α-gal被分为家族4和36，来源于真核生物的α-gal被分为家族27。
Huber等，微生物学文献(Arch.Microbiol).144，324-333(1986)中记载了细菌海栖热袍菌的分离。海栖热袍菌是一种严格厌氧的、棒状的、发酵型、嗜高温的、和在55℃至90℃范围内生长的，最适生长温度约为80℃的真细菌。该真细菌是从意大利和亚速尔群岛的被地温加热的海底分离出来的。那不勒斯栖热袍菌是另一种与海栖热袍菌相关的嗜高温真细菌。从海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌中分离的酶包括β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和半纤维素酶。在已知的α-gal中，只有嗜高温细菌海栖热袍菌的α-gal(TmGalA)和那不勒斯栖热袍菌的α-gal(TnGalA)表现出活性以及在75℃以上持久的稳定性。
动物饲料制剂通常配制成具有平衡的碳水化合物和蛋白质含量，并且被调节成适合于特定动物的生活周期的不同阶段。在许多动物饲料中，含有大量的大豆饼粉。例如，小鸡食物中的大豆饼粉约占蛋白含量的20至30％。
大豆富含蛋白，尤其是富含氨基酸赖氨酸和苏氨酸，但是蛋氨酸的含量很低。蛋白含量高是在动物饲料和人类食品(即，婴儿配方)中广泛使用大豆的原因。据估计，美国大豆饼粉的工业产量是六十亿美元，美国每年大豆饼粉产量的约80％被用于动物饲料中。
大约15％的大豆饼粉不能被单胃动物消化。该15％构成了家禽食物中的食物纤维(为不溶性纤维)。通常，约百分之三至五的该不溶性部分是棉子糖-低聚糖。在其它食物中，如基于豆类或小麦的食物中，棉子糖-低聚糖含量更高，接近35％，并且构成了那些特定类型饲料中的抗营养碳水化合物的大部分。
未被消化的低聚糖的存在可能会对动物饲料能量的最佳利用产生不良的后果。对动物饲料进行酶促处理能够提高可消化和可溶解碳水化合物的可利用性。饲料的表观代谢能(AME)的少量增加能够使成本显著降低。通过去除抗营养因子(即不可消化的低聚糖)、提高可利用碳水化合物组分的消化率以及提高不溶性部分的水溶性可以获得AME的增加，从而使饲料的消耗量减至最小。
典型的大豆饼粉加工顺序的总体方案在动物饲料加工中一般有典型性。在动物饲料的加工过程中，尤其是在含大豆饼粉的动物饲料的加工过程中，利用沸己烷对饲料进行处理以便除去大豆物质(即，大豆片)中的油。然后从油中将所述己烷蒸馏出来并加以回收。己烷处理后，用蒸汽将所述饲料处理一至两分钟以便使蛋白变性以及破坏蛋白酶抑制剂。热处理主要是为了使粉料中的蛋白酶抑制剂变性。这尤其适用于大豆，因为大豆中含有大量的蛋白酶和蛋白酶抑制剂。在该步骤中，含水量被提高到约20％，该步骤在动物饲料加工的全过程中一般是含水量最高的步骤。残余的脲酶活性通常被用作确定蛋白变性程度的量度标准。蒸汽处理后，将所述饲料送到一个脱溶剂器/蒸缸中。在这里，饲料被加热或“蒸煮”从而驱赶掉残余的己烷并使含水量降低到约14％。在该步骤中蛋白进一步发生了变性。蒸缸操作完成后，所述饲料在约180°F(82℃)的温度下(例如，通过挤压)被制成颗粒状物。所述制粒或挤压过程通常持续大约几十秒钟。冷却后，可以使含水量再降低2％至约12％的总含水量。
用于酶促处理动物饲料的该技术通常利用嗜中温来源的酶来制造消化率以及营养价值得到提高的动物饲料。由于所述酶的热稳定性较低以及饲料加工过程中涉及到的高温，这些酶通常必须被用于制粒后的饲料配制的最终加工步骤中。所述的制粒物理加工通常包括加热饲料和通过压模挤压饲料。所述高温对于驱赶掉过量水分和将饲料‘熔解’成颗粒是必需的，否则过量的水分会阻碍结粒。大多数制粒设备能够加工大约1000kg/小时的饲料。
随着颗粒从制粒机中落下并被空气冷却，将酶加到新形成的颗粒中。通常将所述酶溶液从喷嘴垂直喷在落下的饲料颗粒上。以这种方式将酶涂在颗粒上是一种无效的方法，因为(1)酶喷涂率受到所述酶溶液中的含水量的限制(如果所述颗粒被喷得太湿则发生崩解，并且颗粒中含水量高则在贮存过程中促进霉菌和真菌的生长)，和(2)由于这种限制以及颗粒形成得太快，饲料颗粒经常不能被酶完全地包裹起来。当采用这种技术时，估计实际上大约只有五分之一的颗粒被酶包裹起来。
另外，嗜中温酶在动物体内(即，消化后)指标订为活性。由于动物消化道内的pH和蛋白酶的存在，使外源性施加的酶的有效性变得非常低。
因此，需要向动物饲料中施加酶，使得不可消化的低聚糖在被动物摄食之前被分解成单体，并且所述酶在饲料加工采用的高温下具有稳定性。
除了降低人和动物食物中的表观代谢能(AME)外，人和动物食物中的不可消化的低聚糖的存在也是不利的，因为低聚糖的存在会引起胃肠病痛(例如，肠胃气胀和其它胃肠症状)。某些引起肠胃气胀的食物包括豆类(例如，花生、菜豆)、一些十字花科的植物(例如，卷心菜、抱子甘蓝)和某些水果(例如，葡萄干、香蕉、杏)。上述食物引起肠胃气胀的主要原因是机体不能消化这些食物中所含的某些碳水化合物(即，棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖)。由于哺乳动物不具备消化这些碳水化合物的能力，从而使得腐败细菌在大肠中通过发酵来分解这些碳水化合物。结果形成过量的直肠气体，主要是二氧化碳、甲烷和氢气。由于人和其它单胃哺乳动物的消化系统不产生α-半乳糖苷酶或者产生量微乎其微，所以人和其它单胃哺乳动物很难消化这三种低聚糖来释放D-半乳糖。
已知体外利用α-半乳糖苷酶能够使得上述的低聚糖可消化。美国专利US3,966,555；4,241,185；和4,431,737分别公开了通过培养多种微生物来生产和/或稳定α-半乳糖苷酶的方法并且提示了α-D-半乳糖苷酶可被体外用于食品加工和/或通过添加到食品中维持长达12小时。在R.Cruz，等，食品科学杂志(Journal of Food Science)46，1196-1200(1981)中记载了通过添加α-半乳糖苷酶体外水解α-D-半乳糖苷连接的糖。
授予Rohde等的美国专利US5,436,003记载了一种利用含有β-呋喃果糖苷酶、纤维素酶和半纤维素酶的组合物减轻胃肠病痛的方法。以BEANO商标由AkPharma进行销售的液体产品已被描述为一种能够减少或消除肠内气体的酶或食品添加剂，所述肠内气体是当食用了食物如菜豆、花椰菜、糠和其它作为低脂肪、高纤维健康食物的蔬菜和谷物时产生的。BEANO产品含有得自黑曲霉的α-半乳糖苷酶。
不幸的是，存在着某些与已知的利用α-半乳糖苷酶对食物进行体外加工有关的问题，所述加工是为了水解α-D-半乳糖苷连接的糖从而减轻哺乳动物摄取这些糖后出现的症状。通常，所述酶被施加到已被制好的(即煮熟的)食物中。利用酶促方法对完整的(即，未被浸软的或未被咀嚼的)菜豆或其它蔬菜和水果进行处理的效率低且成本高。由于这些食物的坚硬特性，酶只能与底物的外部接触，所以使得酶促反应的效率低、酶活性不可能始终如一和完全有效。最后，利用α-半乳糖苷酶的本方法通常包括在食用食物之前直接使用酶；因而，酶主要在食用后以及消化过程中发挥作用。由于嗜中温α-半乳糖苷酶在高温下的热不稳定性，所以目前使用的产品不能在制作(即，蒸煮、加热)食物之前施用到食物中。所希望的是能够利用一种高温下稳定的α-半乳糖苷酶在以下方面为食品的消费者提供更多的灵活性(1)含不合乎需要的低聚糖的食物的制作和(2)在消化前水解不需要的低聚糖的能力。
本发明人已经发现某些嗜高温酶具有作为改善动物饲料和人类食品品质的加工添加剂的用途。
本发明利用了嗜高温来源的α-半乳糖苷酶，例如来源于海栖热袍菌DSM3109的α-半乳糖苷酶通过水解存在于动物饲料中的含半乳糖的低聚糖而直接处理动物饲料。通过将嗜高温α-半乳糖苷酶制剂直接添加到包括含半乳糖的低聚糖的底物组合物(如含大豆饼粉的动物饲料)中来完成酶处理。本发明的一个优势在于能够在高温，即在通常与动物饲料配制或加工有关的工业加工过程中经常遇到的温度下使用所述酶。
而且，在这些较高的温度下，底物能够更加充分地接近酶，从而使得酶与底物能够完全接触。在酶活性必需的高温下，酶活性所需要的含水量条件被降低了。酶对底物的活性程度还可以通过调节混合物在高温下维持的时间来控制。
因此，本发明一方面涉及一种新的水解含半乳糖的低聚糖的方法，该方法通过使嗜高温α-半乳糖苷酶与一种包括含半乳糖的低聚糖的复杂底物(例如，动物饲料)进行接触，然后加热所述混合物来促进酶介导的水解。
另一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包括一种嗜高温α-半乳糖苷酶与含有含半乳糖的低聚糖的复杂底物(如大豆饼粉、大豆片或动物饲料)的混合物。
本发明的第三个方面涉及一种包括嗜高温来源的α-半乳糖苷酶的组合物，所述α-半乳糖苷酶可被用作一种食品添加剂来减轻人和动物的胃肠病痛。
本发明的第四个方面涉及一种包括嗜高温来源的α-半乳糖苷酶的组合物，所述α-半乳糖苷酶可被用作，例如植物蛋白(即，大豆蛋白)分离过程中的，一种加工添加剂。这种添加剂可用于促进从蛋白产品中去除低聚糖和半乳糖单体，从而预防或减轻人和动物的胃肠病痛。
由于本发明酶的热稳定性高，以及酶在高温下仍具有活性，所以本发明允许在给动物喂食之前，在高温饲料加工过程中对动物饲料进行酶促改性处理。由含水量增高引起的贮存问题由于制粒后酶的施用不再是必需的而得到缓解或解决。由于对较小颗粒(即，与成品颗粒产品相比)进行处理时传质阻力降低，因而实现了酶促效率的提高。最后，含半乳糖的低聚糖的水解使得所述饲料的营养值得到提高(即，被动物可利用的食物能量更加有效)。
因此本发明提供了一种水解存在于底物中的含半乳糖的低聚糖的方法，包括使所述底物与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，并且将底物加热到嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，在该温度下保持一段足以水解所述低聚糖的时间。在一优选的实施方案中，所述低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。在另一个优选的实施方案中，所述底物是动物饲料、大豆饼粉或人类食品。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM3109。在另一个优选的实施方案中，所述低聚糖被水解成半乳糖单体。在另一个优选的实施方案中，所述方法在70％或25％的含水量条件下进行。在另一个优选的实施方案中，所述加热在80℃、85℃、90℃或100℃下进行。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。在另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了一种制备含有被水解的含半乳糖低聚糖的动物饲料组合物的方法，包括在动物饲料的加工过程中使所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，其中在所述动物饲料加工过程中的加热步骤之前使嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组分接触足够长的一段时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解含半乳糖的低聚糖。在一优选的实施方案中，所述含半乳糖的低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。在另一个优选的实施方案中，所述动物饲料包括大豆饼粉、大豆片或是鸡饲料。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM 3109。在另一个优选的实施方案中，所述低聚糖被水解成半乳糖单体。在另一个优选的实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶与动物饲料组合物的组分是在70％、25％或45％的含水量条件下进行接触的。在另一个优选的实施方案中，所述加热是在80℃、85℃、90℃或100℃下进行的。在另一个优选的实施方案中，所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶是在动物饲料加工过程中的最后制粒步骤之前进行接触的。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。优选地，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ IDNO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
在另一个优选的实施方案中，当所述嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组合物的组分进行接触的时候，所述嗜高温α-半乳糖苷酶是液体溶液的形式，干燥的形式、部分纯化或基本纯化的形式。
本发明进一步提供了一种由上述任意一种方法生产的动物饲料。
本发明进一步提供了一种用于减轻哺乳动物胃肠病痛的并且含有嗜高温α-半乳糖苷酶的食品添加剂。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种(Thermotoga sp.T2)。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被分离自海栖热袍菌，更优选地被分离自海栖热袍菌DSM3109。
在另外一个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤制得(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。优选地，所述多核苷酸选自(a)具有SEQ IDNO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了
一种预防哺乳动物胃肠病痛的方法，其中所述胃肠病痛由含有至少一种选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的低聚糖的食物所引起，所述方法包括使所述食物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；然后将所述食物加热足够长的时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解所述的低聚糖。
本发明进一步提供了一种用于在可食用大豆蛋白的加工制作过程中去除含半乳糖的低聚糖的加工添加剂，该加工添加剂含有嗜高温α-半乳糖苷酶。
本发明进一步提供了一种从被用来加工生产可食用大豆蛋白的大豆底物中去除含半乳糖的低聚糖的方法，包括(a)使所述大豆底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；(b)在一定温度下将所述大豆底物加热足够长的时间从而使所述含半乳糖的低聚糖发生水解；和(c)在最终萃取或分级分离可食用大豆蛋白之前从所述大豆底物中去除被分解的含半乳糖的低聚糖。在一个优选的实施方案中，所述加热在从大豆底物中去除油之前进行。在一个优选的实施方案中，所述加热在从大豆底物中去除油之后进行。在一个优选的实施方案中，所述大豆底物是大豆片。
本发明进一步提供了一种由上述任意一项方法生产的可食用的分离大豆蛋白。
本发明的上述以及其它方面通过以下的说明得到详细的解释。
序列表的简要描述SEQ ID NO1海栖热袍菌DSM 3109 galA或gal36基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO2由SEQ ID NO1编码的氨基酸序列。
所述核苷酸序列始于翻译起始密码子GTG。上游的核糖体结合位点序列被省略了。在如本文所述的对该基因进行克隆的过程中，翻译起始密码子GTG被改变为ATG从而有利于插入到紧接在所述核糖体结合位点后面的pET24d+中的唯一NcoI位点中。
附图的简要描述
图1是海栖热袍菌Gal A对PNP-半乳糖的活性随pH变化而发生变化的曲线图。使用了下列缓冲液pH范围2.5至3.5，50mM柠檬酸盐；pH范围4至6，50mM醋酸钠；pH范围6.5至8.50mM磷酸钠。
图2是海栖热袍菌Gal A对PNP-半乳糖的活性随温度变化而发生变化的曲线图。所有测定都是采用50mM醋酸钠缓冲液，0.1M NaCl和1mM PNP-半乳糖进行的。
下面将参照所述附图对本发明进行更加充分的描述，其中叙述了本发明的优选实施方案。然而，本发明可以通过不同的形式来体现而且不应被理解为局限于本文所述的实施方案。相反，提供这些实施方案只是为了充分完整地公开本发明，从而使得本技术领域：
的技术人员充分地理解本发明的范围。
本发明说明书中使用的术语只是为了描述特定的实施方案而不是为了限制本发明。
除非上下文中另有说明，本发明说明书以及所附的权利要求
书中所使用的单数形式的″a″，″an″和″the″同时也包含了复数形式。
除非另有定义，本文中使用的全部科学技术术语具有本发明所属技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献被全文引入作为参考。
除非另有说明，可以采用常规方法来制备本发明的克隆基因、表达盒、载体(例如，质粒)、蛋白质和蛋白质片段。这类技术对于本技术领域：
的技术人员是已知的(参见例如，Sambrook等编辑的《分子克隆实验指南》第二版(Molecular CloningA Laboratory ManualSecond Edition)(冷泉港，纽约1989)；F.M.Ausubel等编辑的《精编分子生物学》(Current Protocols In Molecular Biology)(格林出版联合公司(Green Publishing Associates，Inc)和John Wiley amp;Sons公司，纽约)。
本文中公开的氨基酸序列是按照从左至右，以氨基到羧基的方向进行排列的。所述氨基和羧基没有在序列中体现出来。本文中只以单链的形式从左至右以5’至3’的方向列出了核苷酸序列。核苷酸和氨基酸是按照IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的方式或者(针对氨基酸)按照37CFR§1.822和固定用法，用三字母密码来表示的。参见例如PatentIn用户手册，99-102(1990年11月)(美国专利商标局)。
A.定义本文中的“蛋白”或“酶”是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。所述蛋白可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的肽模拟结构所构成。
因此本文中使用的“氨基酸”或“肽残基”既表示天然存在的氨基酸又表示合成的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。如果使用了非天然存在的侧链，例如为了防止或阻止发生体内降解，可以使用非氨基酸取代基。还可插入化学保护基团或其它化学取代基。
本文使用的“氯基酸序列”是指一种寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。α-半乳糖苷酶片段优选地保留α-半乳糖苷酶的生物活性。其中“氨基酸序列”被本文用来表示天然存在的蛋白分子的氨基酸序列，氨基酸序列等术语，并不意味着将所述氨基酸序列限定在与所述蛋白分子相关的完整和天然氨基酸序列。
本文使用的“扩增”是指制备多拷贝的核酸序列，并且“扩增”通常是利用本技术领域：
熟知的聚合酶链反应(PCR)技术(Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler(1995)PCR引物，实验指南，冷泉港出版社，Plainview，纽约)来进行的。
本文中使用的术语“核酸衍生物”是指编码α-半乳糖苷酶或者与α-半乳糖苷酶或被编码的α-半乳糖苷酶互补的经过化学修饰的核酸。这种修饰包括，例如氢被烷基、酰基或氨基所取代。一种核酸衍生物编码一种保留了天然分子的生物学或免疫学功能的多肽。一种衍生多肽是一种经糖基化、聚乙二醇化或任何类似方法修饰的而仍保留了原生多肽的生物学或免疫学功能的多肽。
本文使用的术语“同源性”是指互补的程度。可能有部分同源或完全同源(即，相同性)。一种至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列采用功能性术语“基本上同源的”来表示。在低严格条件下可以利用一种杂交分析方法(DNA印迹或RNA印迹，溶液杂交等)检测对完全互补序列与靶序列进行杂交的抑制程度。一种基本同源的序列或杂交探针将竞争并抑制完全同源序列与靶序列在低严格条件下的结合。这并不是说低严格条件是那种允许非特异性结合发生的条件；低严格条件需要两种序列之间的相互结合属于特异性(即选择性)的相互作用。通过利用甚至不具有部分互补程度(例如，相同性低于大约30％)的第二种靶序列可以检测不存在非特异性结合。在不存在非特异性结合的情况下，所述探针不与第二种非互补的靶序列发生杂交。
本文中的“核酸”或“寡聚核苷酸”或字义上的等同物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。尽管在某些情况下，具有本技术领域：
已知的替代性骨架的核酸类似物(例如磷酰胺；硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；O-甲基氨基磷酸酯键，以及肽核酸骨架和键)也被包括在内，但是本发明的核苷酸通常含有磷酸二酯键。
本文中交替使用的“核酸序列”和“多核苷酸”指的是一种寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段，以及单链或双链的并且代表有义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA。
如本文中所使用的术语“水解”是指通过酶促活性从含有半乳糖单元的低聚糖的非还原末端去除α-D-半乳糖苷残基。对于低聚糖来说，低聚糖的水解意味着该低聚糖的聚合度(DP)被降低了。所述聚合度的降低可以意味着该低聚糖被水解成一种更小的低聚糖，并且优选地意味着该低聚糖被完全水解成其单体半乳糖单元。
本文中使用的术语“底物”是指含有低聚糖的化合物或混合物，特别是低聚糖水苏糖、棉仔糖和毛蕊花糖。
本申请中具体记载的底物实例包括油料种子粉(即大豆饼粉、低芥酸菜子粉)，植物蛋白片、动物饲料和任何形式的人类食品。
大豆或黄豆被用作本发明底物的一种示范性来源，然而其它底物来源如低芥酸菜子、油菜籽、向日葵籽、亚麻籽、红花籽、芝麻籽和棉花籽也可以被用作本发明的底物来源。因此，在大豆方面所定义的术语如“粉”、“油”、“片”、“饲料”、“蛋白”和“产物”也适用于其它的底物来源。通常，合适的底物来源优选地是油料种子，然而本发明还适用于其它的底物来源。
本文中使用的术语“大豆产品”是任何可食用的或不可食用的、以大豆为天然来源的产品。因此，“大豆产品”可以包括大豆饼粉、大豆油、大豆片、粗大豆饼粉、大豆蛋白和蛋白浓缩物、大豆卵磷脂、大豆皮、大豆分离物或浓缩物、豆腐或任何含有大豆产品如大豆饼粉的动物饲料或人类食品。
通常，“大豆饼粉”被定义为一种从大豆中提取出大豆油后剩余的高蛋白残渣(通常含有40％以上的蛋白)。将大豆加工制成大豆饼粉的各种方法的实例如授予Ronai等的专利号为4,103,034的美国专利中所记载的方法，该专利公开的内容被全文引入本文作为参考。大豆饼粉是一种普通的且一般为优选的制备动物饲料的蛋白来源，并且可以是浸提或排出器提取的、完全或脱壳大豆饼粉，或者是通过本技术领域：
中已知的其它方法进行过加工的大豆饼粉。
“动物饲料”通常含有一种有机物质的混合物，该混合物包括至少一种蛋白源如油料种子粉(即，大豆饼粉)、至少一种碳水化合物源和其它组分如填充物、疏松物、添加的营养物质以及本文中进一步记载的其它成分。动物饲料在本技术领域：
中是已经熟知的并且包括高品质的蛋白质饲料以及其它蛋白质品质较低的饲料。饲料可以包括大豆饼粉、棉花籽粉、羽毛粉、血粉、青贮饲料、肉和骨粉、向日葵籽粉、低芥酸菜子粉、花生粉、红花粉、亚麻籽粉、芝麻粉、早期开花的豆荚、鱼类产品、副产品蛋白质饲料如烧酒糟和啤酒发酵糟、奶产品、家禽产品、干草、玉米、小麦、苜蓿、大麦、买罗高梁、高粱及其混合物。下面将进一步描述动物饲料中可能包含的其它成分。
B.嗜高温α-半乳糖苷酶的特性从嗜热微生物中分离出来的α-半乳糖苷酶(在本文中还被称作“嗜高温酶”或“嗜高温α-半乳糖苷酶”)被用于本发明。可以从中分离α-半乳糖苷酶的嗜热微生物包括细菌栖热菌属的菌种(即，嗜热栖热菌)和栖热袍菌属的菌种。优选的嗜高温微生物包括栖热袍菌属的菌种，包括海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种，其中海栖热袍菌是特别优选的。优选的被分离出来的α-半乳糖苷酶包括那些从海栖热袍菌DSM 3109和那不勒斯栖热袍菌5068，及其突变体或变异体中分离出来的α-半乳糖苷酶。参见例如W.Liebel等，系统应用微生物学(System.Appl.Microbiol).21，1-11(1998)和G.Duffaud等，环境应用微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63,169-177(1997)。
采用本技术领域：
中已知的和本文中记载的技术可以从嗜高温微生物中分离出α-半乳糖苷酶。在G.Duffaud等，环境应用微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63,169-177(1997)中也记载了如何从嗜高温微生物中分离所述的酶。如本发明所使用的，α-半乳糖苷酶可以是天然的、合成的、半合成的或重组的。在一个优选的实施方案中，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶可由一种分离的多核苷酸来编码，其一种优选的实施方案是具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的cDNA。
本发明的酶可以是一种天然纯化产物，或一种化学合成产物，或通过重组技术由原核或真核宿主(例如，由细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞培养物)来制备，下面将更加详细地进行描述。根据重组制备过程中使用的宿主，本发明的酶可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的酶可以含有也可以不含初始蛋氨酸残基。
本发明的酶具有活性的最嗜中温度将随着每种酶和最初从其中分离该酶的每种微生物的不同而改变。
通常，本发明的酶在约75℃以上的温度下具有活性，更优选地是在约80℃以上，以及最优选地是在约85℃以上的温度下具有活性。
本发明的酶可以在高至90℃或甚至高至100℃的温度下仍具有活性。在一个最优选的实施方案中，本发明的酶在正常环境或室温(即，约25℃)下几乎或完全不具有活性。通常，本发明的酶在其最嗜中温度下具有最大的半衰期，所述最嗜中温度通常在约80℃至98℃范围内，更优选地在约85℃至98℃范围内。尽管这些酶在这些温度下的半衰期通常比较短，但是这些酶通常在100℃下仍具有活性。
本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶在具有可变的和宽范围的含水量的环境下具有活性。例如，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶在约70％、约45％、约25％的含水量，甚至含水量更低的条件下具有活性。
技术人员知道利用“定向进化”或代谢工程技术，例如授予Minshull等的美国专利US5,837,458、授予Ladner等的美国专利US5,837,500和授予Stemmer等的美国专利US5,811,238中所述的技术可以将本发明酶的有用变体设计成针对特定底物或条件具有最适活性，所述专利的全部公开内容被引入本文作为参考。
C.嗜高温α-半乳糖苷酶的制备在一个实施方案中，可以按照本技术领域：
中的已知技术从天然嗜高温微生物分离并且任选地纯化嗜高温α-半乳糖苷酶。在G.Duffaud等，应用环境微生物学(Appl.Environmental Microbiol).63，169-177(1997)中可以找到如何从天然嗜高温微生物分离天然存在的嗜高温α-半乳糖苷酶及其合适的条件和试剂的示范性描述。
在另一个实施方案中，克隆和表达了一种编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸(优选地，DNA)来制备本发明使用的酶。然后所表达的蛋白被分离出来并被用于本发明的方法和化合物中。尽管所述酶能以非纯化或部分纯化的形式被用于本发明的方法中，但可以任选地对以这种方式制备的嗜高温酶进行纯化。
用来表达α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列可以是基因组来源的，cDNA，或合成来源的，或其任意组合。所述多核苷酸序列还可以通过常规方法来进行克隆，所述常规方法包括在合适的载体中，克隆来源于任意嗜高温α-半乳糖苷酶产生菌株的cDNA文库；用所述载体转化合适的宿主细胞；在适当的条件下培养所述宿主细胞以便表达由所述cDNA文库中的克隆编码的酶；通过检测由这种克隆产生的酶的嗜高温α-半乳糖苷酶活性来筛选阳性克隆；然后从这类克隆中分离编码所述酶的DNA。
用来表达α-半乳糖苷酶的多核苷酸可以按照已知操作步骤，利用合成的寡核苷酸探针，通过杂交方便地由任何产生嗜高温α-半乳糖苷酶的微生物来克隆，所述寡核苷酸探针是在SEQ ID NO1所示的DNA序列或其任意合适的亚序列的基础上、或在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基础上制备的。或者，所述DNA序列可以通过利用在本文所公开的DNA序列的基础上制备的PCR引物来进行克隆。
如上所述，本发明采用了分离的以及任选纯化的嗜高温α-半乳糖苷酶。这种蛋白可以根据已知技术从表达该蛋白的宿主细胞中分离，或者甚至通过合成来制备。本发明的核酸，含有该核酸的构建物以及表达被编码蛋白的宿主细胞可用来制备本发明的酶。
特定起始信号也可被用来使编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列进行更有效的翻译。这种信号包括起始密码子和相邻序列。如果将编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列、其起始密码子和上游序列插入适当的表达载体中，则可以不需要附加的转录或翻译调控信号。然而，如果只插入了编码序列或其片段，则应当提供包括起始密码子在内的外源翻译调控信号。而且，所述起始密码子应当处于正确的读框中从而确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是多种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。所述表达效率可以通过包含增强子来提高，所述增强子适合于所使用的特定细胞系统，如文献中所记载的那些增强子。参见例如D.Scharf等，Results Probl.Cell Differ.20，125-162(1994)。
本发明编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸包括那些编码与本文公开的蛋白同源且生物学特性基本相同的蛋白的多核苷酸，特别是本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA以及编码本文提供的如SEQ IDNO2所示的嗜高温α-半乳糖苷酶的DNA。该定义旨在包括其天然的等位序列。因此，与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA(或其如下所述的被用作杂交探针的片段或衍生物)杂交的并且通过表达编码本发明蛋白(例如SEQ ID NO2所示的蛋白)的多核苷酸也可用来实施本发明。
可以按照已知技术来确定允许通过表达编码本发明蛋白的其它多核苷酸与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA进行杂交的条件。例如，在一种标准杂交试验中，这些序列与本文公开的如SEQ ID NO1所示的DNA的杂交可以在低严格性、中严格性的条件或甚至在严格条件(例如，分别由在37℃下35-40％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、0.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件；由在42℃下40-45％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、0.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件；和由在42℃下50％的甲酰胺与5×Denhardt溶液、O.5％SDS和1×SSPE的洗涤严格性表示的条件)下进行。通常，编码本发明蛋白并且与本文公开的由SEQ ID NO1所示DNA杂交的序列与SEQ IDNO1分别具有至少75％的同源性，85％的同源性，甚至95％的同源性或者更高的同源性。而且，编码本发明蛋白的多核苷酸，或者与SEQID NO1所示DNA杂交的、但由于遗传密码的简并性密码子序列不同于SEQ ID NO1的多核苷酸也可用来实施本发明。在文献中已知遗传密码的简并性允许不同核酸序列编码相同的蛋白或肽。例如参见授予Toole等的美国专利US4,757,006的第2栏、表1。
尽管编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其变体的核苷酸序列优选地能够在适当选择的严格性条件下与天然存在的嗜高温α-半乳糖苷酶的核苷酸序列杂交，但是有利地是制备嗜高温α-半乳糖苷酶或其具有基本上不同的密码子选择的衍生物。可以对密码子进行选择从而增加肽在特定的原核或真核宿主中的表达速率，以使该表达速率与所述宿主利用特定密码子的频率一致。基本上改变编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其衍生物的核苷酸序列而不改变被编码的氨基酸序列的其它前提包括制备与由天然存在的序列制备的转录物相比具有更理想特性如更长半衰期的RNA转录物。
本发明还包括完全通过化学合成的方法制备编码嗜高温α-半乳糖苷酶及其衍生物的DNA序列或其片段。制备完毕后，可以利用本技术领域：
中熟知的试剂将合成的序列插入到多种可利用的表达载体和细胞系统的任一种中。而且，化学合成方法可被用来将突变引入到一种编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列或其任何片段中。
如本文中公开的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列可被用来制备与本发明的多核苷酸(即，cDNA)或与mRNA发生特异性结合的杂交探针以便确定本发明的蛋白是否发生了扩增或过量表达。
通过遗传工程技术制备克隆基因、重组DNA、载体、被转化的宿主细胞、蛋白和蛋白片段是已知的。例如参见授予Bell等的美国专利US 4,761,371，第6栏第3行至第9栏第65行；授予Clark等的美国专利US 4,877,729，第4栏第38行至第7栏第6行；授予Schilling的美国专利US 4,912,038，第3栏第26行至第14栏第12行和授予Wallner的美国专利US 4,879,224，第6栏第8行至第8栏第59行。(申请人明确表示本文引用的所有专利参考文献中公开的全部内容被引入本文作为参考)。
载体是一种可复制的核酸(优选地是DNA)构建物。载体被本发明用来扩增编码本发明所述蛋白的DNA或表达本发明的蛋白。表达载体是一种可复制的核酸构建物，在该构建物中编码本发明所述酶的核酸序列与合适的控制序列进行可操作性连接，该控制序列能够实现本发明所述酶在一种合适宿主中的表达。对这类控制序列的需要将随着所选宿主和所选转化方法而变化。控制序列一般包括转录启动子、任选的控制转录的操纵基因序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。总之，所需要的是在宿主中的复制能力，通常是由复制起点所赋予的，以及一个便于识别转化体的选择基因。
载体包括但不限于质粒、病毒(例如，腺病毒、巨细胞病毒)、噬菌体、反转录病毒和能够整合的DNA片段(即，通过重组能够整合到宿主基因组中的片段)。所述载体能够独立于所述宿主基因组来进行复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合到所述基因组当中。表达载体优选地含有一个启动子和与需要表达的基因进行可操作性连接的RNA结合位点且可在宿主微生物中具有可操作性。
当核酸区域之间功能相关时，它们之间进行可操作性地连接或可操作性地结合。例如，如果一个启动子控制编码序列的转录，那么它就与该序列进行可操作性的连接；如果为了进行翻译而将核糖体结合位点定位，那么核糖体结合位点就与一个编码序列进行可操作性的连接。通常，可操作性的连接意味着连续的，对于前导序列是连续的并且是在读框内。
被转化的宿主细胞是指那些被含有本发明编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸的载体转化或转染的细胞，该细胞不必须，但优选地表达嗜高温α-半乳糖苷酶。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母细胞或高等真核生物细胞。
原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌(E.Coli)或芽孢杆菌，其中E.Coli是优选的。E.Coli通常被最初来源于pBR322(参见Bolivar等，基因2，95(1977))的质粒或源于该质粒的载体所转化。
表达载体优选地含有一个被所述宿主细胞识别的启动子。这通常，尽管不一定，是指从目的宿主中获得的启动子。所述启动子和SD序列(用于原核宿主的表达)可操作性地与本发明的DNA进行连接，即，它们被定位以便促进由该DNA开始进行信使RNA的转录。在本发明中，优选的启动子包括已知的λPL、T7和Pm启动子。通常用于重组微生物表达载体的其它启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，自然(Nature)275，615(1978)；和Goeddel等，自然(Nature)281，544(1979)；色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，核酸研究(Nucleic Acids Res).8，4057(1980)和EPO公开号为36,776的专利申请)；和tac启动子(H.De Boer等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80，21(1983)。尽管上述启动子是常用的，但其它的微生物启动子也是合适的。已经公开了许多有关核苷酸序列的详细内容，使得技术人员能够将有关核苷酸序列与质粒或病毒载体中编码蛋白质的DNA可操作性地连接在一起(Siebenlist等，细胞(Cell)20，269(1980))。
真核微生物如酵母培养物也可以被适当的编码嗜高温α-半乳糖苷酶的载体所转化。参见美国专利US 4,745,057。在低等真核宿主微生物中，最常用的是啤酒糖酵母，尽管一些其它的菌株通常也可使用。酵母载体可以含有一个源于2微米的酵母质粒或自主复制序列(ARS)的复制起点、一个启动子、编码所需蛋白的DNA、用于聚腺苷酸化和转录终止的序列和一个选择基因。一个质粒的实例是YRp7，(Stinchcomb等，自然(Nature)282，39(1979)；Kingsman等，基因(Gene)7，141(1979)；Tschemper等，基因(Gene)10，157(1980))。该质粒含有trp1基因，从而提供了一种用于不具有利用色氨酸进行生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，遗传学(Genetics)85，12(1977)。然而酵母宿主细胞基因组中的trp1被破坏后能够提供一种通过在没有色氨酸存在的条件下进行生长来检测转化的有效环境。
酵母载体中的合适的启动序列包括金属硫蛋白的启动子、3-磷酸-甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化学杂志(J.Biol.Chem).255，2073(1980)或其它糖酵解酶(Hess等，酶调节进展杂志(J.Adv.EnzymeReg).7，149(1968)；和Holland等，生物化学(Biochemistry)17，4900(1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。用于酵母表达的合适载体和启动子被进一步记载在R.Hitzeman等，EPO公开号73,657中。
源于多细胞生物的细胞培养物也可被用于重组蛋白的合成。原则上，任何高等真核细胞培养物都是可以使用的，不管是来源于脊椎动物还是来源于包括昆虫细胞在内的无脊椎动物培养物。这种细胞在细胞培养物中的繁殖成为一种常规过程。参见组织培养(TissueCulture)(学术出版社(Academic Press)，Kruse和Patterson，编辑)(1973)。用于这种细胞的表达载体通常包括(如果需要)一个复制起点、一个位于待表达基因上游的启动予以及一个核糖体结合位点、RNA剪接位点(如果使用了含有内含子的基因组DNA)、一个聚腺苷酸化位点和一个转录终止序列。
宿主细胞如昆虫细胞(例如，被培养的草地夜蛾细胞)和表达载体如杆状病毒表达载体也可被用来制备用于实施本发明的蛋白，如授予Smith等的美国专利US 4,745,051和US 4,879,236。一般来说，杆状病毒表达载体含有一个杆状病毒基因组，该基因组含有被插入到多角体蛋白基因的一个位点中的待表达基因，所述位点的范围是从多角体蛋白的转录起始信号至ATG起始位点并且处于杆状病毒多角体蛋白启动子的转录控制之下。
另外，可以选择一种能够调控被插入序列的表达或能够以所需方式对所表达的蛋白进行加工的宿主细胞菌株。蛋白多肽的这种修饰包括，但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。对“前原”形式的蛋白进行裂解的翻译后加工也可被用来促使正确的插入、折叠和/或发挥功能。具有特定细胞结构和特定翻译后作用机制的不同宿主细胞(例如，CHO，HeLa，MDCK，HEK293和WI38)可从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Bethesda，Md.)得到并且可被选择用来确保外源蛋白的正确修饰和加工。
为了长期、高产率地制备重组蛋白，稳定的表达是优选的。例如，能够稳定表达嗜高温α-半乳糖苷酶的细胞系可以被在同一个或不同载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件以及一个选择性标记基因的表达载体所转化。引进了所述载体后，在被转移到选择性培养基中之前，可以将细胞在富集培养基中培养1-2天。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在使得成功表达被引进序列的细胞得到培养和回收。被稳定转化的细胞的抗性克隆可以利用适合于细胞类型的组织培养技术进行增殖。
被编码嗜高温α-半乳糖苷酶的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于表达以及从细胞培养物中回收蛋白的条件下进行培养。由被转化细胞产生的酶根据所使用的序列和/或载体可以被分泌出来或被含在胞内。正如本技术领域：
的技术人员所能理解的，含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸的表达载体可以被设计成含有指导嗜高温α-半乳糖苷酶通过原核或真核细胞膜进行分泌的信号序列。其它构建可以被用来连接编码嗜高温α-半乳糖苷酶的序列与编码有利于可溶性蛋白进行纯化的多肽结构域的核苷酸序列。
通过利用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化所述酶。如果需要，在建立成熟蛋白构型的过程中可以利用蛋白重折叠步骤。最后，高效液相色谱(HPLC)可以被用于最终的纯化步骤。
通常，本技术领域：
的技术人员知晓可以对本发明肽的氨基酸序列进行较少的删除或取代而不会降低其活性。因此，含有这种缺失或取代的肽也属于本发明的一个方面。在含有置换或取代的氨基酸的肽中，肽序列中的一个或多个氨基酸可以被一个或多个其它氨基酸所取代，其中这种取代不影响所述序列的功能。这种变化可以根据氨基酸之间在物理特性如电荷密度、疏水性/亲水性、大小和构型方面的已知相似性来进行，从而使得氨基酸被功能特性基本相同的其它氨基酸所取代。例如Ala可以被Val或Ser取代；Val可以被Ala，Leu，Met或Ile取代，优选地被Ala或Leu取代；Leu可以被Ala，Val或Ile取代，优选地被Val或Ile取代；Gly可以被Pro或Cys，优选地被Pro所取代；Pro可以被Gly，Cys，Ser，或Met取代，优选地被Gly，Cys或Ser取代；Cys可以被Gly，Pro，Ser或Met取代，优选地被Pro或Met取代；Met可以被Pro或Cys取代，优选地被Cys取代；His可以被Phe或Gln取代，优选地被Phe取代；Phe可以被His，Tyr或Trp，优选地被His或Tyr取代；Tyr可以被His，Phe或Trp取代，优选地被Phe或Trp取代；Trp可以被Phe或Tyr取代，优选地被Tyr取代；Asn可以被Gln或Ser取代，优选地被Gln取代；Gln可以被His，Lys，Glu，Asn，或Ser取代，优选地被Asn或Ser取代；Ser可以被Gln，Thr，Pro，Cys或Ala取代；Thr可以被Gln或Ser，优选地被Ser取代；Lys可以被Gln或Arg取代；Arg可以被Lys，Asp或Glu，优选地被Lys或Asp取代；Asp可以被Lys，Arg或Glu取代，优选地被Arg或Glu取代；以及Glu可以被Arg或Asp取代，优选地被Asp取代。一旦进行了改变，就可以按照常规筛选方法来确定这些改变对酶功能的影响。
除了重组制备的方法外，嗜高温α-半乳糖苷酶的片段可以通过利用固相技术(J.Merrifield，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc).85，2149-2154(1963))进行定向肽合成来制备。通过手工技术或通过自动化方法可以进行蛋白质合成。例如，利用应用生物系统431 A肽合成仪(Perkin Elmer)可以进行自动化合成。可以分别化学合成嗜高温α-半乳糖苷酶的各种片段然后利用化学方法进行连接从而制备出全长分子。
D.利用嗜高温α-半乳糖苷酶的方法和组合物被分离的α-半乳糖苷酶被用于含半乳糖的低聚糖和含该低聚糖的化合物、底物和复杂混合物的水解反应中。
通过本发明的α-半乳糖苷酶水解的低聚糖包括但不限于棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖和PNP-半乳糖。
在优选的实施方案中，本发明的α-半乳糖苷酶被用于制备动物饲料。动物包括哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物，其中哺乳动物和鸟类是特别优选的。当动物是哺乳动物时，家畜是优选的，包括牛、猪、马和羊。当动物是鸟类时，优选的动物是鸡和火鸡。当动物是鱼类时，优选的动物是鲶鱼。
动物饲料(例如，鸡和其它家禽饲料，家畜饲料，家养动物饲料)通常通过混合不同的成分或组分来制备，所述成分或组分(即“活性成分”)被发现有必要与必需载体物质混合以便提供所需形式的饲料。所述饲料或饲料成分可以是任何需要的成分，优选地包括蛋白和碳水化合物。活性成分的选择取决于营养价值或取决于某些通过所述成分的活性获得的特性。酶或蛋白、氨基酸、色素、维生素、抗氧化剂、抗生素、着色剂和类胡萝卜素也可以被添加到所述饲料中。显然，这些成分的混合物可以同时加入或者连续加入。
动物饲料中的蛋白成分优选地以某种蛋白粉(即大豆饼粉)的形式加入。蛋白粉的合适形式如上所详述。蛋白源的其它实例包括单细胞蛋白或蛋白水解物如来源于酵母、藻类或细菌的蛋白水解物；被分离的动物蛋白、肽或蛋白水解物如血红蛋白、肌球蛋白、血浆或其它血清蛋白、胶原、酪蛋白、白蛋白或角蛋白的水解物；复杂蛋白源或蛋白水解物如奶、血、乳清、血粉、肉粉、羽毛粉、鱼粉、肉和骨粉、家禽副产品、家禽副产品粉、孵化副产品、禽蛋副产品、蛋白、蛋黄和无壳蛋的水解物；植物蛋白或蛋白水解物如分离的大豆蛋白、小麦蛋白、麦胚、烤酒糟和谷蛋白的水解物。在本发明的一个优选实施方案中，所述的动物饲料的蛋白源是一种植物蛋白源，在一个更优选的实施方案中，蛋白源是是大豆，任何可用形式的大豆包括大豆饼粉、大豆片、粗大豆饼粉等。
含在动物饲料中的碳水化合物为动物提供了一种营养源，另外能够有助于形成固体饲料。有用的碳水化合物包括玉米面粉、土豆淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、纤维素、果胶、琼脂糖和树胶；生物可利用的糖如葡萄糖、果糖和蔗糖；化学改性淀粉如改性玉米淀粉、甲基纤维素、羧甲基纤维素和糊精；湿润剂如甘油或丙二醇；转化糖；和磨碎的改性碳水化合物如玉米、大米、燕麦、大麦、小麦、高粱、黑麦、小米、木薯、黑小麦和木薯，它们以完整的、磨碎的、粉碎的、磨成粉的、碾压的、挤压的、制粒的、脱脂的、脱水的、浸提的或其它的加工形式存在。
所述动物饲料可以且优选地确实含有水分(即，水)和组合物成分。在一个实施方案中，所述动物饲料可以由一种含有溶解在水中的树胶的胶体溶液来制备。可以用于此目的的树胶通常是植物或动物源的高分子量的分子，通常具有胶体特性，其在适当的溶剂中能够产生凝胶，所述分子是如琼脂、褐藻胶和来源于海藻的角叉菜胶、植物渗出物如阿拉伯树胶、加贴胶和黄芪胶、植物提取物如果胶、植物种子如瓜尔豆、角豆荚、和动物渗出物如血浆、血清白蛋白、卵清蛋白、壳多糖和明胶。其它树胶包括直链淀粉和支链淀粉以及细菌源的树胶。
所述动物饲料优选地抗微生物生长。即，如果处理得当，通过密封和在室温下持续贮存至少约八个星期，所述动物饲料没有出现长菌现象。例如通过灭菌、向饲料中加入微生物生长抑制剂如对羟基苯甲酸甲酯或一种山梨酸酯或调节所述饲料混合物的pH来稳定所述饲料。
为了增加适于某些应用如长期饲养的营养价值，所述饲料优选地含有一种氨基酸源如蛋白质、氨基酸、氨基酸前体或类似物，及其混合物。氨基酸的实例是必需氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、精氨酸和赖氨酸。氨基酸前体的实例是例如由Novus International(St.Louis，Mo.)销售的、商标为Aliment的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸，以及2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的盐如其钙盐和钠盐。
尽管对于某些应用不是优选的，但是所述饲料还可以包括较低比例的脂肪或脂类。合适的脂肪包括脂肪酸如亚油酸；分离的植物油如向日葵、红花、大豆、花生、低芥酸菜子、玉米、油菜籽、橄榄、亚麻籽和棕榈的油；脂肪粉如棉籽、花生、油菜籽、棕榈粉和坚果粉；和动物源的脂肪如蛋黄、猪油、黄油、家禽脂肪、牛羊脂和鱼油。
所述动物饲料还可以含有维生素和矿物质。维生素添加剂可以选自，例如，维生素A、B12、生物素、胆碱、叶酸、烟酸、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺、C，D，25-羟基D，E和K。矿物添加剂可以选自，例如，钙、磷、硒、氯、镁、钾、钠、铜、碘、铁、锰、和吡啶甲酸铬(chromium piccolinate)。
所述动物饲料还可以含有其它的非-α半乳糖苷酶如作用于其它种类化合物如蛋白、非淀粉多糖、脂类等的水解酶。授予Ivey等的美国专利5,985,336中列举了更全的可被本发明利用的酶、激素、抗生素、着色剂、稳定剂、氨基酸源和酶，该专利公开的全部内容被引入本文作为参考。
动物饲料组分(例如，大豆饼粉)和动物饲料本身的加工可以包括几个在高温(即，60℃以上，70℃以上或甚至80℃以上)下实施的步骤。具体地，可以在加工过程中对动物饲料的组分进行蒸汽处理从而，例如，除去溶剂或者“蒸煮”所述粉以获得一定的营养特性。通常，所述动物饲料的加工终止于使所述饲料形成颗粒或其它动物食用所需形式的挤压或成形工艺。所需形式可以是粉末、颗粒、溶液或悬浮液。优选的形式取决于应用条件、组成和向最终用户目的地运输的方法。
在本发明中，本文记载的嗜高温α-半乳糖苷酶可以在例如大豆、其它豆类、豆荚、玉米、小麦、燕麦、甜菜、低芥酸菜子、稻米或其它谷物或蛋白源的去壳或去皮后的饲料或粉的加工，一直到并且包括动物饲料的制粒或挤压过程中的任意时候被添加到所述的动物饲料中。在本发明中，例如，可以在混合所述饲料的各种成分时加入所述嗜高温α-半乳糖苷酶。唯一对饲料加工过程中嗜高温α-半乳糖苷酶加入时机的限制是所述酶必须在进行高温(即，高于约60℃、70℃、75℃或80℃)加工步骤之前加入。优选地，所述嗜高温α-半乳糖苷酶在进行加工过程中对动物饲料成分或动物饲料进行蒸汽处理之前加入。
所述嗜高温α-半乳糖苷酶能以包括液体形式(即，所述酶处于溶液或培养物中)或干粉形式在内的任何合适的形式被加到动物饲料成分或动物饲料中。如果以干燥形式加入，嗜高温α-半乳糖苷酶可以是被喷雾干燥的、冻干的、冷冻干燥的或通过本技术领域：
中已知的其它合适的加工方法干燥的。
嗜高温α-半乳糖苷酶能以粗制形式、部分纯化形式、基本纯化形式或纯化形式被加入。
在饲料加工过程中加入嗜高温α-半乳糖苷酶提供了某些超过现有技术的优势。所述嗜高温α-半乳糖苷酶在动物饲养加工过程中采用的高温下具有活性。因此，解除了只能在制粒或挤压工艺后才能应用所述酶的需要。用嗜高温α-半乳糖苷酶处理后，所述动物饲料仍然保留半乳糖和蔗糖单体作为动物的可利用和可消化的能源。由于抗营养因子(即，不可消化的低聚糖)通过所述酶被去除了，因此由于半乳糖和蔗糖的可利用性的提高而增加了能量值，并且也增加了蛋白的利用率。最终，所述酶在动物消化所述饲料前具有活性，因而保证了动物能够利用由分解低聚糖带来的任何营养优势。
在本发明的另一个实施方案中，嗜高温α-半乳糖苷酶被用作人类食品的食品添加剂。本发明利用嗜高温α-半乳糖苷酶的优势在于所述酶的高温活性。即，由于通过蒸煮或加热而施加给所述食品的高温能够激活所述酶，所以酶可在制作如蒸煮之前被加到食品中。在这个实施方案中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶在食品包装前被加到食品中(例如加到待加热的大豆奶中)，或者在蒸煮前被加到食品上。嗜高温α-半乳糖苷酶分解不可消化的低聚糖的活性由此能够减轻如上所述的胃肠病痛。
当被用作食品添加剂时，嗜高温α-半乳糖苷酶能以包括液体或粉末在内的几种形式中的任一种来使用。粉末形式的酶可以被包装在或保存在一种“盐-摇筛”或其它类型的粉末分配器中，所述粉末可以在蒸煮前被喷洒在食品上。粉末形式的嗜高温α-半乳糖苷酶可以与一种或多种也可以是粉末或干燥形式的赋形剂混合。可以与一种食品级的α-半乳糖苷酶混合的干燥成分的代表性实例包括但不限于葡萄糖、磷酸二钙、微晶纤维素、改性纤维素和改性淀粉。这些赋形剂可从已知商业来源获得。选择这些赋形剂的标准是除了能够作为α-半乳糖苷酶的可摄取的非毒性载体外，还要具有适口性和易流动性。
液体形式的所述酶可添加到瓶装、罐装或其它容器装的食品中。被浓缩的(高纯度的)液体α-半乳糖苷酶可以通过采用一种溶剂如水溶解或混合一种干燥或粉状的酶来制备。所述液体形式的酶可以利用其它合适的稀释液体或赋形剂来稀释。稀释度取决于使用目的。液体赋形剂的代表性实例包括，但不限于水、甘油和山梨醇。用于选择合适的液体赋形剂的标准可包括可混溶性、稳定性和适口性。
在本发明的另一个实施方案中，嗜高温α-半乳糖苷酶可被用作在制备可食用的植物蛋白产品(本文中还被称作可食用的蛋白分离物或可食用的蛋白浓缩物)如可食用的大豆蛋白产品的过程中使用的加工添加剂。具体地，本发明的嗜高温α-半乳糖苷酶可帮助从蛋白产品中去除不需要的低聚糖和半乳糖单体，因此使得制备的植物蛋白产品部分、基本或完全不含半乳糖或低聚糖组分。
制备分离的大豆蛋白和其它植物蛋白的方法是已知的。例如参见授予Johnson等的美国专利US 5,936,069以及网址www.centralsoya.com.由于营养原因，从分离的大豆产品中去除低聚糖或碳水化合物有时是需要的。目前从蛋白分离物中除去低聚糖的方法通常是耗时的、昂贵的和困难的。
以分离的大豆蛋白的加工作为实例，在本发明的方法中，在可食用大豆蛋白的加工过程中，所述嗜高温α-半乳糖苷酶被加到大豆底物(例如，一种大豆片混合物)中。将含有大豆底物和嗜高温α-半乳糖苷酶的混合物加热到如上文所述的嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，并且保持足够长的时间以便使所述大豆混合物中的低聚糖水解。可以在除去大豆底物中的油之前或之后加入嗜高温α-半乳糖苷酶，但是优选地在提取或进一步纯化分离形式的大豆蛋白之前加入。一旦被水解，就可以通过本技术领域：
中已知的方法从离析大豆蛋白中除去低聚糖，如通过采用水或含水乙醇进行冲洗或通过等电沥滤来从被分离的大豆蛋白中除去低聚糖。因而，可以制备出来源于大豆加工的部分或完全缺乏含半乳糖的低聚糖的可食用植物蛋白产品。通过这种方式，可以减轻或防止离析大豆蛋白食用者的如上所述的胃肠病痛，因为不希望有的低聚糖已从离析大豆蛋白中除去。
下列实施例被提供用来说明本发明，而不应当被理解为对本发明的限制。
实施例1Tm galA的克隆和表达通过PCR从基因组制备的Tm全长DNA中克隆Tm galA。35个循环后，得到了长度约为1.65kb的单一PCR产物。与由公开的DNA序列产生的限制图谱相比，利用BamHI、XhoI、NdeI、KpnI和HindIII的限制图谱产生了正确的带型和正确大小的DNA片段。SEQ ID NO1表示GenBank数据库中公开的Tm galA核苷酸序列(登记号2660640)。该序列被用来制备用于克隆该基因PCR引物。
在以pET24d+作为表达载体(Novagen，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA)的大肠杆菌BL21(λDE3)中表达Tm galA。在对弗氏压榨细胞提取物进行热处理(80℃，30分钟)后，从4L培养物中回收到大约330个单位的可溶性Tm GalA活性(1个单位的酶活性被定义为每分钟从PNP-半乳糖中释放1μmol PNP所需的酶量)。在12％的SDS-PAGE凝胶上清楚地辨别出一条约64kDa的蛋白带。该条带对应于如以前W.Liebl等，系统应用微生物(System.Appl.Microbiol).21，1-11(1998)中所述的Tm GalA的单一单体。
实施例2Tm GalA活性采用在405nm下测定10分钟后释放游离PNP的终点测定法以PNP-半乳糖为底物测定温度和pH的最适值。简单地说，就是在1mL的分析物中含有1mM PNP-半乳糖和用含1mM NaCl的50mM醋酸钠缓冲液适当稀释的酶。10分钟后，通过加入100μl的1M Na2CO3并将该反应混合物置于冰上来终止反应。图1和图2表示分别作为pH和温度的函数的酶百分比活性。从这些图中可以清楚地看到所述反应的最适值为大约4.5的pH和85℃的温度。
如表1所示，随着底物的聚合度(DP)升高，Tm GalA活性降低。以PNP-半乳糖为底物时Tm GalA的活性达到最大值，而以棉子糖(DP3)为底物时，Tm GalA的活性则降低了约2.5倍，以及以水苏糖(DP4)和毛蕊花糖(DP5)为底物时，Tm GalA的活性则降低了20倍。从水苏糖至毛蕊花糖预计还可以观察到比活性的进一步降低。然而，在所采用的测定技术(Somogyi-Nelson技术)的误差范围内，无法观察到这一现象。Somogyi-Nelson技术可分析总还原糖的产生。因此，由毛蕊花糖或水苏糖释放的半乳糖与从毛蕊花糖中去除了半乳糖的产物之间无法进行区别。
表1.Tm GalA比活性
实施例3鸡饲料的Tm GalA消化在对所述饲料的直接酶促处理过程中和对再溶解的乙醇提取的组分进行处理时表明了Tm GalA消化可溶性鸡饲料组合物的正效应。乙醇提取法提供了一种通过从所述饲料基质中提出饲料的水溶性碳水化合物部分来对Tm GalA消化鸡饲料组分进行更加详细分析的方法。通过这种技术提取的碳水化合物通常被限制到DP＜8。采用250mL的80％的沸腾乙醇完全回流2小时来对25g的饲料进行提取。通过蒸发乙醇，留下桔黄色的残渣。在混合5分钟和在85℃下加热30分钟后，该残渣可以被部分溶解在10倍体积的水(w/v)中。可溶性部分的HPLC分析结果表明在约37，42和46分钟时具有三个不同的峰。基于与已知标准进行比较的保留时间可以将约37和42分钟时出现的峰分别推定为水苏糖和蔗糖。采用15个单位的Tm GalA对可溶性部分处理1小时后，可以观察到‘水苏糖’峰完全消失了。该特定实验中的水苏糖的初始浓度估计约为5.6mM。除了水苏糖的消失，在约47分钟时可以观察到半乳糖峰的出现，同时伴随着蔗糖峰从t＝0时的4.77×107面积计算值增加到一小时后的5.44×107面积计算值。
采用50个单位的Tm GalA直接处理饲料(100mg ml-1)产生了与对提取可溶性的部分进行消化的结果相似的结果。在这些实验中，在加入所述酶之前，将饲料在98℃下预加热2小时。同前面的研究相同，在头一个小时内，可以观察到在HPLC色谱中的水苏糖峰完全消失的同时伴随着半乳糖峰的出现。
实施例4温度和含水量对Tm GalA消化大豆饼粉和大豆片的影响表2说明了温度对Tm GalA直接消化大豆饼粉和大豆片的影响。利用4克大豆饼粉或大豆片、50U的α-Gal/500mg的粉或片和70％的含水量进行实验。在表2列出的温度下将所述大豆饼粉/片-α-Gal混合物总共温育45分钟。在实验过程中，以5分钟的间隔将所述混合物的样品放置在冰上，然后即刻用80％的乙醇进行提取并按照实施例3中的记载进一步进行加工。然后通过HPLC分析重新悬浮的部分。可以将在约35、39和42分钟时出现的峰分别确定为水苏糖、棉子糖和蔗糖。将麦芽六糖或麦芽五糖用作内标。对各时间点的剩余水苏糖和棉子糖浓度进行线性回归从而得出表2中的比率。从所示数据可以看出，随着温度降低，水苏糖和棉子糖从所述粉或片中的去除率也降低了。这可以给出所述酶的温度/活性的变化曲线。
表2.随温度的不同而变化的低聚糖去除率a，b
a在70％的过量含水量的条件下采用单位U的α-Gal进行的实验b每分钟每克物质每单位α-Gal低聚糖的去除率(％)c括号中的数字表示给定实验的R2值。
表3显示了含水量对TmGalA直接消化大豆饼粉和大豆片的影响。除了温度被固定在90℃以及含水量的变化如表3所示外，按照与上述相似的条件进行实验。在90℃下进行温育前，通过在真空和45℃下对大豆饼粉/大豆片-α-Gal混合物进行温育直到获得适当的含水量来实现含水量的变化。该处理完成后，如上所述进行实验。由表3中的数据可以明显看出含水量对a-Gal消化大豆饼粉和大豆片的比率影响并不显著，估计直到达到含水量的某一临界值才会有影响。
表3.随过量含水量的不同而变化的低聚糖去除率a，b
a在90℃下采用50单位的α-Gal进行的实验b每分钟每克物质每单位α-Gal低聚糖的去除率(％)c括号中的数字表示给定实验的R2值。
实施例5结果概述源于海栖热袍菌(Tm)DSM 3109的α-半乳糖苷酶(GalA)已被成功地克隆出来被初步定性。所述酶具有约4.5-5.0的最适pH和约85-90℃的最嗜中温度。所述酶对PNP-半乳糖、棉子糖(DP3)、水苏糖(DP4)和毛蕊花糖(DP5)具有活性。表1列出了Tm GalA相对各种底物的比活性。而且，所述酶在pH7和90℃的条件具有70分钟的半衰期，表明在饲料加工过程中经蒸汽处理后仍具有活性能力。另外，在25℃(pH4.5)下Tm GalA对PNP-半乳糖只显示出其最大活性的3％，表明室温下TmGalA对聚合度较高的棉子糖-低聚糖的活性可能最低。Tm GalA对高蛋白含量和高碳水化合物含量的鸡饲料的初始消化物产生了阳性结果。Tm GalA对被溶解的、乙醇提取的鸡饲料组分进行消化的结果表明所述酶能够从所述饲料中有效去除被认定是水苏糖的组分。还对从未加工的、未处理的鸡饲料中去除可溶性水苏糖进行了观察。
上述内容只是对本发明的说明而不意味着对本发明的限制。通过后续的权利要求
对本发明进行了限定，其中包括了所述权利要求
的等同内容。
序列表 110 Syngenta Participations AG 120 高温水解复杂混合物中的含半乳糖的低聚糖的方法 130 A-31512A 140
141
150 US 60/220,211 151 2000-07-22 160 2 170 PatentIn版本2.0 210 1 211 1659 212 DNA 213 海栖热袍菌 220
221 CDS 222 (1)..(1659) 400 1atg gaa ata ttc gga aag gcc ttc aga gag gga aga ttc gtt ctc aaa 48Met Glu Ile Phe Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu Lys1 5 10 15gag aaa aac ttc aca gtt gag ttc gcg gtg gag aag ata cac ctt ggc 96Glu Lys Asn Phe Thr Val Glu Phe Ala Val Glu Lys Ile His Leu Gly20 25 30tgg aag atc tcc ggc agg gtg aag gga agt ccg gga agg ctt gag gtt 144Trp Lys Ile Ser Gly Arg Val Lys Gly Ser Pro Gly Arg Leu Glu Val35 40 45ctt cga acg aaa gca ccg gaa aag gta ctt gtg aac aac tgg cag tcc 192Leu Arg Thr Lys Ala Pro Glu Lys Val Leu Val Asn Asn Trp Gln Ser50 55 60tgg gga ccg tgc agg gtg gtc gat gcc ttt tct ttc aaa cca cct gaa 240Trp Gly Pro Cys Arg Val Val Asp Ala Phe Ser Phe Lys Pro Pro Glu65 70 75 80ata gat ccg aac tgg aga tac acc gct tcg gtg gtg ccc gat gta ctt 288Ile Asp Pro Asn Trp Arg Tyr Thr Ala Ser Val Val Pro Asp Val Leu
85 90 95gaa agg aac ctc cag agc gac tat ttc gtg gct gaa gaa gga aaa gtg 336Glu Arg Asn Leu Gln Ser Asp Tyr Phe Val Ala Glu Glu Gly Lys Val100 105 110tac ggt ttt ctg agt tcg aaa atc gca cat cct ttc ttc gct gtg gaa 384Tyr Gly Phe Leu Ser Ser Lys Ile Ala His Pro Phe Phe Ala Val Glu115 120 125gat ggg gaa ctt gtg gca tac ctc gaa tat ttc gat gtc gag ttc gac 432Asp Gly Glu Leu Val Ala Tyr Leu Glu Tyr Phe Asp Val Glu Phe Asp130 135 140gac ttt gtt cct ctt gaa cct ctc gtt gta ctc gag gat ccc aac aca 480Asp Phe Val Pro Leu Glu Pro Leu Val Val Leu Glu Asp Pro Asn Thr145 150 155 160ccc ctt ctt ctg gag aaa tac gcg gaa ctc gtc gga atg gaa aac aac 528Pro Leu Leu Leu Glu Lys Tyr Ala Glu Leu Val Gly Met Glu Asn Asn165 170 175gcg aga gtt cca aaa cac aca ccc act gga tgg tgc agc tgg tac cat 576Ala Arg Val Pro Lys His Thr Pro Thr Gly Trp Cys Set Trp Tyr His180 185 190tac ttc ctt gat ctc acc tgg gaa gag acc ctc aag aac ctg aag ctc 624Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Trp Glu Glu Thr Leu Lys Asn Leu Lys Leu195 200 205gcg aag aat ttc ccg ttc gag gtc ttc cag ata gac gac gcc tac gaa 672Ala Lys Asn Phe Pro Phe Glu Val Phe Gln Ile Asp Asp Ala Tyr Glu210 215 220aag gac ata ggt gac tgg ctc gtg aca aga gga gac ttt cca tcg gtg 720Lys Asp Ile Gly Asp Trp Leu Val Thr Arg Gly Asp Phe Pro Ser Val225 230 235 240gaa gag atg gca aaa gtt ata gcg gaa aac ggt ttc atc ccg ggc ata 768Glu Glu Met Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Gly Phe Ile Pro Gly Ile245 250 255tgg acc gcc ccg ttc agt gtt tct gaa acc tcg gat gta ttc aac gaa 816Trp Thr Ala Pro Phe Ser Val Ser Glu Thr Ser Asp Val Phe Asn Glu260 265 270cat ccg gac tgg gta gtg aag gaa aac gga gag ccg aag atg gct tac 864His Pro Asp Trp Val Val Lys Glu Asn Gly Glu Pro Lys Met Ala Tyr275 280 285
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485 490 495tac gag atc gtc tcg tct ggc act ctc tca gga aac gtc aag atc gtg 1536Tyr Glu Ile Val Ser Ser Gly Thr Leu Ser Gly Asn Val Lys Ile Val500 505 510gtc gat ctg aac agc aga gag tac cac ctg gaa aaa gaa gga aag tcc 1584Val Asp Leu Asn Ser Arg Glu Tyr His Leu Glu Lys Glu Gly Lys Ser515 520 525tcc ctg aaa aaa aga gtc gtc aaa aga gaa gac gga aga aac ttc tac 1632Ser Leu Lys Lys Arg Val Val Lys Arg Glu Asp Gly Arg Asn Phe Tyr530 535 540ttc tac gaa gag ggt gag aga gaa tga 1659Phe Tyr Glu Glu Gly Glu Arg Glu545 550 210 2 211 552 212 PRT 213 海栖热袍菌 400 2Met Glu Ile Phe Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu Lys1 5 10 15Glu Lys Asn Phe Thr Val Glu Phe Ala Val Glu Lys Ile His Leu Gly20 25 30Trp Lys Ile Ser Gly Arg Val Lys Gly Ser Pro Gly Arg Leu Glu Val35 40 45Leu Arg Thr Lys Ala Pro Glu Lys Val Leu Val Asn Asn Trp Gln Ser50 55 60Trp Gly Pro Cys Arg Val Val Asp Ala Phe Ser Phe Lys Pro Pro Glu65 70 75 80Ile Asp Pro Asn Trp Arg Tyr Thr Ala Ser Val Val Pro Asp Val Leu85 90 95Glu Arg Asn Leu Gln Ser Asp Tyr Phe Val Ala Glu Glu Gly Lys Val100 105 110Tyr Gly Phe Leu Ser Ser Lys Ile Ala His Pro Phe Phe Ala Val Glu115 120 125Asp Gly Glu Leu Val Ala Tyr Leu Glu Tyr Phe Asp Val Glu Phe Asp
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权利要求
1.一种水解存在于底物中的含半乳糖的低聚糖的方法，该方法包括使所述底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；和将所述底物加热到嗜高温α-半乳糖苷酶具有活性的温度，并保持足够长的时间从而使所述低聚糖发生水解。
2.如权利要求
1所述的方法，其中所述低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。
3.如权利要1所述的方法，其中所述底物选自动物饲料、大豆饼粉和人类食物。
4.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
5.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
6.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
7.如权利要求
1所述的方法，其中所述低聚糖被水解成半乳糖单体。
8.如权利要求
1所述的方法，其中所述方法在70％含水量的条件下进行。
9.如权利要求
1所述的方法，其中所述方法在25％含水量的条件下进行。
10.如权利要求
1所述的方法，其中所述加热在80℃、85℃、90℃或100℃下进行。
11.如权利要求
1所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
12.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
13.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
14.如权利要求
11所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
15.一种制备含有被水解的含半乳糖低聚糖的动物饲料组合物的方法，包括在动物饲料的加工过程中使所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶进行接触，其中在所述动物饲料加工过程中的加热步骤之前使嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组分接触足够长的一段时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解含半乳糖的低聚糖。
16.如权利要求
15所述的方法，其中所述含半乳糖的低聚糖选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖。
17.如权利要求
15所述的方法，其中所述动物饲料包括大豆饼粉、大豆片或是鸡饲料。
18.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
19.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
20.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
21.如权利要求
15所述的方法，其中所述低聚糖被水解成半乳糖单体。
22.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶与动物饲料组合物的组分是在70％、25％或45％的含水量条件下进行接触的。
23.如权利要求
15所述的方法，其中所述加热步骤是在80℃、85℃、90℃或100℃下进行的。
24.如权利要求
15所述的方法，其中所述动物饲料组合物的组分与嗜高温α-半乳糖苷酶是在动物饲料加工过程中的最后造粒步骤之前进行接触的。
25.如权利要求
15所述的方法，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
26.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
26.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
27.如权利要求
25所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
28.如权利要求
15所述的方法，其中当所述嗜高温α-半乳糖苷酶与所述动物饲料组合物的组分进行接触时，所述嗜高温α-半乳糖苷酶是液体溶液的形式，干燥的形式、部分纯化或基本纯化的形式。
29.一种由权利要求
15所述的方法生产的动物饲料。
30.一种用于减轻哺乳动物胃肠病痛的食品添加剂，该食品添加剂含有一种嗜高温α-半乳糖苷酶。
31.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌和埃氏热袍菌，以及栖热袍菌属T2种。
32.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌。
33.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶分离自海栖热袍菌DSM3109。
34.如权利要求
30所述的食品添加剂，其中所述嗜高温α-半乳糖苷酶通过以下步骤来制备(a)培养携带含有编码嗜高温α-半乳糖苷酶的多核苷酸序列的表达载体的宿主细胞；(b)表达嗜高温α-半乳糖苷酶；和(c)从宿主细胞培养物中回收嗜高温α-半乳糖苷酶。
35.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1的序列。
36.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸选自(a)具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的多核苷酸；和(c)编码嗜高温α-半乳糖苷酶并且由于遗传密码的简并性而不同于(a)或(b)的DNA的多核苷酸。
37.如权利要求
34所述的食品添加剂，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的嗜高温α-半乳糖苷酶。
38.一种预防哺乳动物胃肠病痛的方法，其中所述胃肠病痛由含有至少一种选自棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的低聚糖的食物所引起，所述方法包括使所述食物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；然后将所述食物加热足够长的时间以使嗜高温α-半乳糖苷酶水解所述的低聚糖。
39.一种用于在可食用大豆蛋白的加工制作过程中去除含半乳糖的低聚糖的加工添加剂，该加工添加剂含有嗜高温α-半乳糖苷酶。
40.一种从被用来加工生产可食用大豆蛋白的大豆底物中去除含半乳糖的低聚糖的方法，包括使所述大豆底物与嗜高温α-半乳糖苷酶接触；在一定温度下将所述大豆底物加热足够长的时间从而使所述含半乳糖的低聚糖发生水解；和在最终萃取或分级分离可食用大豆蛋白之前从所述大豆底物中去除被分解的含半乳糖的低聚糖。
41.如权利要求
40所述的方法，其中所述加热在从所述大豆底物中去除油之前进行。
42.如权利要求
40所述的方法，其中所述加热在从所述大豆底物中去除油之后进行。
43.如权利要求
40所述的方法，其中所述
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发布于 ： 2021-03-25
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